| Summary: | Abstract : 5-Methylcytosine is an epigenetic mark, which can be oxidized to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in DNA by ten-eleven translocation (TET) oxygenases. It is an initial step in the demethylation of 5mC. Levels of 5hmC is relatively high in the brain compared to other organs, but these levels are known to be significantly reduced during the development of a brain tumor, especially in glioblastoma multiforme (GBM). However, no known mechanisms may fully explain this abnormality. The objectives of my project were to (1) understand the implications of the demethylation pathway mediated by TET, and (2) gain a deeper insight in the epigenetic make-up of brain tumors. (1) U87 cells were incubated with 5mC, 5hmC, 5-formylcytosine (5fC) or co-incubated of 5hmC with 3,4,5,6-tetrahydro-2’-deoxyuridine (dTHU) over a timeline of 0, 24, 48 and 96 hours. (2) 130 brain tumors (GBM= 79; grade II/III= 51) were obtained directly from surgery and immediately suspended in DNA extraction buffer. Both cell samples and tumor tissues underwent DNA extraction and DNA digestion protocols. The percent per cytosine (%/C) was obtained by quantification of 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxymethyluracil (5hmU) and 5formyluracil (5fU) using LC-MS/MS. (1) Cellular incubations showed that it is possible to increase levels of 5hmC in DNA, but also a slight increase in 5mC levels throughout the experiment. 5HmC levels dramatically increased by 1.9-fold after 96h. On the other hand, no increase was observed in 5fC levels. Both 5hmC and 5fC incubations were accompanied by high increases in 5hmU and 5fU levels respectively. The addition of dTHU to the 5hmC incubation decreased 5hmU incorporation by 65%. (2) The average levels of 5mC, 5hmC and 5fC, in brain tumors, were 4.0, 0.15 and 0.021 %/C respectively. 5HmU and 5fU levels were present at comparable levels of 5hmC and 5fC. Levels of 5hmC, 5hmU and 5fU were significantly lower in the DNA of GBM specimens. There was a strong correlation between 5mC with 5hmC and 5fC in GBM, but this was absent in low grade tumors. The presence of 5hmU and 5fU in brain tumor and the increase in their levels during cell incubations indicate a deamination activity in these cancerous cells, which may impinge on the cellular levels of 5hmC, in particular. Furthermore, upon the incubations with 5hmC, downstream levels of 5fC did not increase suggesting a TET malfunction. TET activity is maintained in GBMs, but impaired in low grade tumors due to isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1) mutations. Therefore, in brain tumors, a strong deamination activity and TET impairment may lead to epigenetic reduction of 5hmC. === Résumé : 5Mtéthylcytosine (5mC) est une marque épigénétique qui peut être oxydée en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) par ten-eleven translocation (TET) oxygénases. Ceci amène à l’étape initiale de la déméthylation de 5mC. Le niveau de 5hmC est plus élevé dans le cerveau par rapport aux autres organes. Par contre, ce niveau a une réduction marquante au cours du développement d’une tumeur cérébrale, notamment le glioblastome multiforme (GBM). Toutefois, il n’y a aucun mécanisme connu pour expliquer cette anomalie. Les objectifs de ce projet étaient de (1) discerner l’implication de la voie de déméthylation obtenu par médiation de TET et (2) d’avoir une compréhension plus profonde de la constitution épigénétique des tumeurs cérébraux. (1) Des cellules U87 ont été incubées avec 5mC, 5hmC, 5-fomylcytosine (5fC) et une co-incubation de 5hmC avec 3,4,5,6-tétrahydro-2’-déoxyuridine (dTHU). Les échantillons ont été récoltés à 0, 24, 48, 96 heures. (2) 130 tumeurs cérébraux (GBM = 79; grade II/III = 51) étaient obtenus directement de chirurgie et mise en suspension dans un tampon d’extraction d’ADN le jour même. Les échantillons d’U87 et de tissu tumoral ont subi les protocoles d’extraction et de digestion d’ADN. Le pourcentage par cytosine (%/C) était calculé par la quantification de 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxyméthyluracile (5hmU) et 5-formyluracile (5fU) en utilisant LC-MS/MS. (1) Les incubations d’U87 ont démontrées la possibilité augmenter les niveaux génomique de 5hmC, mais aussi une légère augmentation des niveaux de 5mC. Les niveaux de 5hmC ont accru de 1.9 fois après 96hrs. Par contre, aucune variation n’a été observée dans les niveaux de 5fC. Les incubations de 5hmC et 5fC ont été accompagnées par une élévation des niveaux de 5hmU et 5fU respectivement. L’addition de dTHU avec 5hmC avait diminué l’incorporation de 5hmU par 65%. (2) Dans les tumeurs cérébraux, les niveaux moyens de 5mC, 5hmC et 5fC étaient de 4.0, 0.15 et 0.021%/C respectivement. Les quantités de 5hmU et 5fU étaient grandement plus faible dans le GBMs que dans les tumeurs de bas grades. La présence de 5hmU et 5fU dans les tumeurs et leur augmentation durant l’incubation des U87 indiquent une activité de désamination, qui peut, en particulier, entraver les niveaux de 5hmC. En outre, malgré l’incubation avec 5mC, les niveaux de 5hmC et 5fC n’ont pas augmentés suggérant un dysfonctionnement de TET. L’activité de TET est maintenue dans GBM, mais altérée dans les tumeurs de bas grades à cause de mutation isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1). Par conséquent, la forte activité de désamination et la déficience en TET peuvent conduire à une réduction épigénétique.
|
|---|
