La chitosanase de streptomyces SP. N174 études de résidus essentiels à l'activité, au maintien de l'intégrité et à la classification des chitosanases

L'objectif de ce travail consistait à améliorer les connaissances de la liaison spécifique d'un enzyme avec son substrat. Pour ce faire nous avons utilisé la chitosanase de Streptomyces sp. N174. Cet enzyme est une endohydrolase qui clive des liens [bêta]1-4 entre des sous-unités glucosami...

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Main Author: Tremblay, Hugo
Other Authors: Brzezinski, Ryszard
Language:French
Published: Université de Sherbrooke 2002
Online Access:http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/5025
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spelling ndltd-usherbrooke.ca-oai-savoirs.usherbrooke.ca-11143-50252016-04-07T05:24:50Z La chitosanase de streptomyces SP. N174 études de résidus essentiels à l'activité, au maintien de l'intégrité et à la classification des chitosanases Tremblay, Hugo Brzezinski, Ryszard L'objectif de ce travail consistait à améliorer les connaissances de la liaison spécifique d'un enzyme avec son substrat. Pour ce faire nous avons utilisé la chitosanase de Streptomyces sp. N174. Cet enzyme est une endohydrolase qui clive des liens [bêta]1-4 entre des sous-unités glucosamines et/ou N -acétyl glucosamines, ce qui en fait un modèle d'étude très intéressant et représentatif d'un grand nombre d'enzymes, soit les glycosidases. Ces enzymes hydrolysent une grande variété de substrats glycosidiques. Il existe deux structures principales qui permettent d'accomoder les différents substrats, la forme en baril composé de 8 feuillets [bêta] et de 8 hélices a liés en alternance, et la structure composée de deux lobes accomodant le substrat en son centre. Cette structure est principalement composée d'hélices [alpha]. La chitosanase de Streptomyces sp. N174 se replie selon cette dernière structure. Ce qui fait que les résultats découlant de notre étude pourront être appliqués à d'autres enzymes possédant une structure homologue car malgré le peu d'homologie des séquences, il existe une grande homologie au niveau des structures tertiaires. De plus, lé substrat des chitosanases est un substrat binaire, composé de deux types de sous-unités de glucosamine ou de N -acétyl glucosamine. Ceci permet d'étudier l'effet des mutations sur la reconnaissance spécifique du substrat et de mesurer leurs impacts sur la reconnaissance spécifique d'une sous-unité par rapport à l'autre. De plus, le substrat est relativement peu coûteux et disponible rapidement en quantités importantes. Nous avons ainsi étudié deux résidus qui, selon les résultats disponibles à cette époque pouvaient être impliqués dans la liaison au substrat de manière spécifique en se liant aux groupements amines des sous-unités glucosamines du chitosane. Ces deux résidus sont faspartate 57 et le glutamate 197. Ils ont tous deux été étudiés par mutagenèse dirigée. L'aspartate 57 a été remplacé par une alanine et une asparagine alors que le glutamate 197 a été remplacé par une glutamine, un aspartate, une asparagine et une alanine. Diverses techniques ont été utilisées pour caractériser les différents mutants soit la détermination des constantes cinétiques (K[indice inférieur M] , V[indice inférieur max]), la dénaturation thermique et le profil d'hydrolyse de l'hexamère de glucosamine. L'ensemble des résultats obtenus nous a permis de démontrer que ces deux résidus étaient impliqués dans la liaison au substrat par la chitosanase de Streptomyces sp. N74. Nous avons aussi développé un outil d'identification moléculaire qui permet d'identifier de façon fiable une chitosanase de la famille 46 et 80 seulement à partir de sa séquence en acides aminés."--Résumé abrégé par UMI. 2002 Thèse 0612805522 http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/5025 fre © Hugo Tremblay Université de Sherbrooke
collection NDLTD
language French
sources NDLTD
description L'objectif de ce travail consistait à améliorer les connaissances de la liaison spécifique d'un enzyme avec son substrat. Pour ce faire nous avons utilisé la chitosanase de Streptomyces sp. N174. Cet enzyme est une endohydrolase qui clive des liens [bêta]1-4 entre des sous-unités glucosamines et/ou N -acétyl glucosamines, ce qui en fait un modèle d'étude très intéressant et représentatif d'un grand nombre d'enzymes, soit les glycosidases. Ces enzymes hydrolysent une grande variété de substrats glycosidiques. Il existe deux structures principales qui permettent d'accomoder les différents substrats, la forme en baril composé de 8 feuillets [bêta] et de 8 hélices a liés en alternance, et la structure composée de deux lobes accomodant le substrat en son centre. Cette structure est principalement composée d'hélices [alpha]. La chitosanase de Streptomyces sp. N174 se replie selon cette dernière structure. Ce qui fait que les résultats découlant de notre étude pourront être appliqués à d'autres enzymes possédant une structure homologue car malgré le peu d'homologie des séquences, il existe une grande homologie au niveau des structures tertiaires. De plus, lé substrat des chitosanases est un substrat binaire, composé de deux types de sous-unités de glucosamine ou de N -acétyl glucosamine. Ceci permet d'étudier l'effet des mutations sur la reconnaissance spécifique du substrat et de mesurer leurs impacts sur la reconnaissance spécifique d'une sous-unité par rapport à l'autre. De plus, le substrat est relativement peu coûteux et disponible rapidement en quantités importantes. Nous avons ainsi étudié deux résidus qui, selon les résultats disponibles à cette époque pouvaient être impliqués dans la liaison au substrat de manière spécifique en se liant aux groupements amines des sous-unités glucosamines du chitosane. Ces deux résidus sont faspartate 57 et le glutamate 197. Ils ont tous deux été étudiés par mutagenèse dirigée. L'aspartate 57 a été remplacé par une alanine et une asparagine alors que le glutamate 197 a été remplacé par une glutamine, un aspartate, une asparagine et une alanine. Diverses techniques ont été utilisées pour caractériser les différents mutants soit la détermination des constantes cinétiques (K[indice inférieur M] , V[indice inférieur max]), la dénaturation thermique et le profil d'hydrolyse de l'hexamère de glucosamine. L'ensemble des résultats obtenus nous a permis de démontrer que ces deux résidus étaient impliqués dans la liaison au substrat par la chitosanase de Streptomyces sp. N74. Nous avons aussi développé un outil d'identification moléculaire qui permet d'identifier de façon fiable une chitosanase de la famille 46 et 80 seulement à partir de sa séquence en acides aminés."--Résumé abrégé par UMI.
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