| Summary: | La industria alimentaria, en respuesta a la demanda por parte de los
consumidores de alimentos naturales, frescos y libres de conservantes químicos,
ha desarrollado tecnologías de conservación no térmicas. El CO2
supercrítico
(SC-CO2
), representa una tecnología no térmica de inactivación prometedora, ya
que está encaminada a producir el mínimo impacto sobre las propiedades
nutricionales y organolépticas de los alimentos. Sin embargo, en algunos casos se
requieren condiciones de presión o temperatura elevadas, así como tratamientos
excesivamente largos para garantizar la seguridad y estabilidad de los alimentos.
En este sentido, con el objetivo de obtener la letalidad requerida empleando
procesos más cortos o de menor intensidad, en el presente trabajo se ha
desarrollado una combinación del SC-CO2
con ultrasonidos de potencia (HPU) y
de SC-CO2
con altas presiones hidrostáticas (HHP), para ser empleadas en
procesos de inactivación microbiana y enzimática.
El objetivo principal de la presente Tesis fue evaluar tecnologías no térmicas
de conservación basadas en la combinación de SC-CO2
y HPU, y en la
combinación de SC-CO2
y HHP. Respecto a la combinación de SC-CO2
con
HPU, se estudio la influencia del estado de crecimiento de las células, de las
condiciones del proceso, de la naturaleza del medio y del uso o no de HPU, sobre
las cinéticas de inactivación de microorganismos (Escherichia coli (E. coli) y
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)) y enzimas (pectin-metil-esterasa
(PME)). Se emplearon modelos matematicos y técnicas de microscopia para
describir las cinéticas y los mecanismos de inactivación, respectivamente. En
cuanto a la combinación de SC-CO2
y HHP, se evaluó el efecto de la adición de
diferentes niveles de CO2
en el envase sobre la eficacia del tratamiento con HHP
para inactivar PME, peroxidasa (POD) y polifenol oxidasa (PPO) en feijoa pure.
Se estudió la influencia del estado de crecimiento de las células de E. coli y
S. cerevisiae inoculadas en medio de cultivo, LB e YPD Broth, respectivamente,
sobre sus cinéticas de inactivación con SC-CO2
(350 bar, 35 ºC). Cultivos
individuales de E. coli y S. cerevisiae se incubaron hasta que las células
alcanzaron cuatro estados de crecimiento diferentes, desde la fase temprana
exponencial hasta la fase estacionaria, para posteriormente ser tratadas con
SC-CO2
a 350 bar y 35 ºC. Se comparó el proceso combinado de SC-CO2+HPU con el tratamiento de SC-CO2
para evaluar el efecto de los HPU sobre las
cinéticas de inactivación con SC-CO2
de E. coli y S. cerevisiae en la fase
temprana estacionaria, inoculados ambos microorganismos en medios de cultivo,
y se determinó el efecto de diferentes temperaturas (31-41 ºC, 225 bar) y
presiones (100-350 bar, 36 ºC). Con el objetivo de conocer los mecanismos de
inactivación asociados a esta tecnología combinada (SC-CO2+HPU) se realizó un
estudio morfológico. Se estudiaron las diferencias entre células de E. coli y
S. cerevisiae no tratadas, tratadas con SC-CO2 (350 bar, 36 ºC, 5 min) y con
SC-CO2+HPU (350 bar, 36 ºC, 5 min, 40 W) usando microscopía óptica (LM) y
microscopía electrónica de transmisión (TEM). Se seleccionó el zumo de
manzana y de naranja para estudiar la inactivación de ambos microorganismos
con SC-CO2+HPU en matrices reales; además, se estudió la inactivación de la
enzima pectin-metil-esterasa (PME) del zumo de naranja. Las experiencias se
llevaron a cabo a diferentes temperaturas (31-41 ºC, 225 bar) y presiones
(100-350 bar, 36 ºC). Las condiciones de temperatura y presión seleccionadas
superan el punto crítico del CO2
y son menores que las condiones letales para
ambos microorganismos. Tanto E. coli como S. cerevisiae se han seleccionado
para el presente trabajo porque son componentes habituales de la flora
responsable del deterioro de alimentos y son comúnmente empleados como
indicadores de contaminación en alimentos.
Se investigó la combinación de los SC-CO2
con HHP para determinar el
efecto de diferentes niveles de CO2
(solo HHP (HHP); carbonatación y HHP
(HHPcarb); carbonatación + adición de 8.5 ml de CO2
/ g puré en el espacio de
cabeza del paquete y HHP (HHPcarb+CO2
)) sobre la eficacia del tratamiento con
HHP para inactivar PME, peroxidasa (POD) y polifenol oxidasa (PPO) en puré
de feijoa contenido en una bolsa de plástico, a diferentes presiones (300, 450 y
600 MPa, durante 5 min).
Los resultados mostraron que la resistencia de ambos microorganismos a los
tratamientos de inactivación con SC-CO2
aumentó progresivamente conforme la
fase de crecimiento avanzó, lo cual podría deberse a la activación de sistemas de
protección naturales que desarrollan los microorganismos conforme se acercan a
la fase estacionaria de crecimiento. Las cinéticas de inactivación de E. coli y
S. cerevisiae se ajustaron al modelo de Weibull (R2
= 0.93; RMSE = 0.59) y al
modelo de Gompertz (R2
= 0.96; RMSE = 0.53), respectivamente, que fueron adaptados para considerar la fase de crecimiento como uno de los parámetros de
dichos modelos.
Empleando SC-CO2
, la velocidad de inactivación de ambos microorganismos
aumentó progresivamente con la presión y la temperatura. El tiempo necesario
para alcanzar una inactivación completa de E. coli (8 ciclos-log) se redujo de 60
a 25 min al aumentar la presión de 100 a 350 bar (36 ºC), y de 75 a 40 min al
aumentar la temperatura de 31 a 41 ºC (225 bar). La inactivación completa de
S. cerevisiae (7 ciclos-log) se alcanzó únicamente tras 140 min de proceso a
350 bar y 36 ºC. En general, presiones y temperaturas más elevadas mejoran la
solubilización del SC-CO2
en el medio e incrementan la fluidez de la membrana
celular, respectivamente, facilitando el contacto y la penetración del CO2
, lo que
favorece el descenso del pH intracelular y la extracción de componentes vitales
para la célula. Sin embargo, al aplicar HPU en los tratamientos de SC-CO2
en
medios de cultivo, se observó una drástica inactivación microbiana, alcanzándose
una reducción total (107
-108
ciclos-log) tras solo 1-2 min de tratamiento.
Aplicando SC-CO2+HPU no se observó un efecto significativo en el nivel de
inactivación al aumentar la presión o la temperatura debido a que los HPU
generan una vigorosa agitación que acelera los mecanismos de inactivación
asociados a los SC-CO2
y enmascara el efecto de estas variables del proceso.
Además, la cavitación generada por los HPU podría dañar la pared celular de los
microorganismos, acelerando su inactivación. El estudio de la existencia de un
posible efecto sinérgico entre ambas tecnologías reveló que la combinación de
SC-CO2
y HPU tuvo un mayor efecto en la inactivación que la adición de los
efectos individuales de ambas. Para E. coli, se alcanzó una reducción de 0.3, 0.9
y 8 ciclos-log tras 5 min de tratamiento con SC-CO2
, HPU y SC-CO2+HPU,
respectivamente; para S. cerevisiae se alcanzó una reducción de 6.83 ciclos-log
tras 2 min de tratamiento con SC-CO2+HPU, mientras que tras el mismo periodo
de tiempo con sólo SC-CO2
o HPU no se observó ninguna reducción en el
número de microorganismos.
En todos los tratamientos llevados a cabo, la levadura S. cerevisiae mostró
mayor resistencia a los tratamientos con SC-CO2
que la bacteria E. coli, lo cual
podría estar relacionado con el mayor espesor de la pared celular de S. cerevisiae
comparado con el de E. coli, 124.8 nm frente a 17.7 nm, respectivamente. Sin
embargo, al combinar el SC-CO2
y los HPU, la agitación vigorosa y la cavitación del medio enmascaró las diferentes resistencias mostradas por ambos
microorganismos en los tratamientos con SC-CO2
.
Las imágenes de LM y TEM mostraron que tras 5 min de tratamiento con
SC-CO2
se produjo una distribución irregular del contenido citoplasmático y
aparecieron pequeñas modificaciones en la envoltura celular, no siendo ninguno
de estos cambios letales para las células de E. coli ni de S. cerevisiae. Además,
las mayores diferencias entre ambos microorganismos se identificaron en el
efecto sobre la envoltura celular: en S. cerevisiae se observaron ligeras
modificaciones aunque no se apreció rotura de la pared celular, mientras que la
pared de las células de E. coli aparecieron con un alto grado de disolución,
pérdida de cohesividad, protuberancias y algunas áreas desintegradas. Sin
embargo, 5 min de tratamiento con SC-CO2+HPU fueron suficientes para
alcanzar una inactivación completa de ambos microorganismos. Las imágenes de
LM y TEM revelaron mayor proporción de regiones vacías dentro de las células
tratadas con SC-CO2+HPU, lo que indicó una clara reducción del contenido
citoplasmático. La envoltura de las células de E. coli se desintegró totalmente,
mientras que las paredes de las células de S. cerevisiae perdieron parcialmente su
estructura laminada y se pudieron observar algunas paredes rotas. Por tanto, los
mecanismos de inactivación asociados a los SC-CO2+HPU podrían estar
relacionados con el fenómeno de cavitación generado por los HPU, el cual daña
bruscamente la envoltura celular incrementando tanto la ruptura de la membrana
celular como la desintegración del contenido intracelular. Los daños generados
por el tratamiento de SC-CO2+HPU fueron tan severos que evitaron una posible
recuperación de las células durante un almacenamiento posterior al tratamiento
(6 semanas a 4 ºC).
En promedio, la inactivación de ambos microorganismos con SC-CO2+HPU
en zumo de manzana (5.3 min) fue más lenta que en zumo de naranja (4.6 min);
y en ambos zumos más lenta que en medios de cultivo (1.5 min). Esto podría
estar relacionado con el contenido de azúcar del medio y la solubilización del
CO2
en el mismo. El azúcar se liga al agua del medio, por tanto, la cantidad de
agua disponible donde el CO2
puede disolverse es menor en zumo de manzana
(15.6 ºBrix) que en zumo de naranja (11.6 ºBrix); y menor en ambos zumos que
en LB (2 ºBrix) o YPD (5 ºBrix) Broth. Además, empleando SC-CO2+HPU, la
velocidad de inactivación de ambos microorganismos inoculados en zumos
aumentó con la presión y la temperatura. Esto podría estar relacionado con la composición de los zumos, los cuales no se saturan rápidamente de CO2
en los
tratamientos con SC-CO2+HPU como sí ocurre en las experiencias llevadas a
cabo sobre medios de cultivo, de manera que un incremento de presión o
temperatura puede facilitar la solubilización del CO2
.
Contrariamente a los resultados obtenidos con SC-CO2+HPU sobre medios de
cultivo, donde no se observaron diferencias entre E. coli y S. cerevisiae, en
zumos E. coli mostró mayor resistencia que S. cerevisiae. En promedio, para
alcanzar una completa inactivación de E. coli y S. cerevisiae se necesitó un
tiempo de tratamiento de 6.6 y 3.3 min, respectivamente. En zumos, la vigorosa
solubilización del CO2
generada por los HPU podría estar dificultada por un
mayor contenido de azúcar, por tanto los mecanismos de inactivación podrían
estar gobernados principalmente por el fenómeno de cavitación y el tamaño de
los microorganismos. El tamaño de las células de S. cerevisiae es mucho mayor
que el de las de E. coli, por tanto, la probabilidad de que las burbujas de
cavitación afecten a la estructura celular será mayor para S. cerevisiae que para
E. coli.
Por otro lado, la inactivación de la enzima PME mediante SC-CO2+HPU
aumentó con la presión y la temperatura, aunque su inactivación completa no se
alcanzó en ninguna de las condiciones estudiadas. La inactivación de enzimas
tratadas mediante SC-CO2
se debe a la bajada de pH, al efecto inhibitorio del
CO2
sobre la actividad enzimática y a los cambios estructurales generados por el
SC-CO2
. La enzima PME mostró mayor resistencia a los tratamientos con
SC-CO2+HPU que los microorganismos E. coli o S. cerevisiae en zumo de
naranja (se alcanzó una reducción del 18.9 %, 62.4 % y 88.1 %, a 36 ºC y
225 bar tras 2 min de tratamiento, respectivamente), lo que puede atribuirse a la
diferente naturaleza y tamaño de los microorganismos y las enzimas.
El modelo de Peleg Tipo A (R
2 = 0.936; RMSE = 0.561) y el modelo de
Weibull (R2 = 0.923; RMSE = 0.561) se adaptaron para describir las cinéticas de
inactivación de E. coli y S. cerevisiae con SC-CO2+HPU en zumo de manzana,
respectivamente, incluyendo la presión y la temperatura como parámetros de
dichos modelos. El modelo Bifásico (R
2 = 0.960; RMSE = 0.391), el modelo de
Peleg Tipo B (R
2
= 0.894; RMSE = 0.687) y el modelo fraccional (R2 = 0.931;
RMSE = 0.085), se adaptaron para describir las cinéticas de inactivación de E. coli, S. cerevisiae y PME con SC-CO2+HPU en zumo de naranja,
respectivamente, incluyendo como parámetros de dichos modelos la presión y la
temperatura.
Los resultados revelaron que la actividad residual de las enzimas PME, POD
y PPO descendió conforme aumentó la presión, ya que la presión genera un
desorden estructural que puede cambiar la estructura tri-dimensional de las
enzimas. Las muestras tratadas con HHPcarb+CO2 mostraron un mayor grado de
inactivación de las tres enzimas, comparado con las muestras tratadas con
HHPcarb o HHP, en cualquier condición de presión seleccionada. Esto podría
deberse a una mayor cantidad de CO2
disuelto, que provocaría una mayor caída
de pH y la consecuente desnaturalización de las enzimas. Además, el CO2
disuelto en el puré durante el tratamiento de HHP, podría generar un repentino y
significativo burbujeo durante la despresurización, que podría contribuir a
generar mayores cambios estructurales responsables de la inactivación
enzimática.
Finalmente, se puede concluir que la combinación de SC-CO2
con HPU o
HHP mejoró los mecanismos de inactivación de microorganismos y enzimas. La
aplicación de HPU agiliza los tratamientos con SC-CO2
, acelerando la
solubilización del CO2
en el medio, que es el primer paso en los tratamientos con
SC-CO2
; y generando el fenómeno de cavitación que daña las paredes celulares,
facilitando tanto la penetración del SC-CO2
a las células como la extracción de
componentes intracelulares, lo que acelera la muerte de las células microbianas.
Además, la combinación de SC-CO2 con HHP aceleró la inactivación de enzimas
en comparación con HHP. Empleando estas tecnologías combinadas, se pueden
utilizar tiempos de proceso razonables para la industria alimentaria, así como
condiciones de tratamiento suaves, lo que resultaría en una reducción del coste
del proceso y en una minimización del impacto sobre las propiedades
nutricionales y organolépticas de los productos tratados.
Se recomienda llevar a cabo mas investigaciones para conocer
detalladamente los mecanismos de inactivación de microorganismos y enzimas
con SC-CO2+HPU y SC-CO2+HHP. Tambien sería interesante conocer el efecto
de estas tecnologías no térmicas combinadas sobre las propiedades
físico-químicas de los alimentos tratados y sobre la aceptación de los mismos por
parte del consumidor. === Ortuño Cases, C. (2014). Aplicación de ultrasonidos de potencia para la mejora de procesos de inactivación con fluidos supercríticos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/39344 === TESIS
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