Regulation of the initiation of DNA replication: Interplay between DNA topology and chromatin structure

• Main Author: Rampakakis, Emmanouil
• Other Authors: Maria Hadjopoulos (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2009
• Subjects: Biology - Molecular
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=40783

DNA replication initiates at replication origins and involves the ordered assembly of a pre-Replicative Complex (pre-RC), consisting of the ORC1-6, Cdc6, Cdt1 and MCM2-7 proteins. The Ku heterodimer (Ku70/Ku80) was previously implicated in the pre-RC assembly but its mechanism of action is yet unknown. Here, Ku is shown to form a complex with DNA topoisomerase IIβ (topo IIβ) both in vitro and in vivo and target it onto replication origins. The enzymatic activity of topo IIβ creates transient, origin-specific dsDNA breaks thus affecting the DNA topology during pre-RC assembly. Pharmacological inhibition of the topo II activity interferes with the pre-RC assembly at the level of ORC, Cdt1 and Cdc45 recruitment resulting in prolonged G1 phase. Similarly, RNAi-mediated inhibition of the Ku80 expression leads to reduced chromatin loading of pre-RC proteins, decreased origin activation, and activation of a cell cycle checkpoint through a mechanism involving low Cdk2 activity. Overall, the data implicate Ku in the initiation of DNA replication through regulation of the DNA topology and suggest the interplay of the DNA replication and cell-cycle machineries. Pre-RC assembly is followed by the recruitment of the replicative machinery which initiates DNA replication. Study of the chromatin structure of the human lamin B2 and hOrs8 and the monkey Ors8 origin revealed that dynamic changes within the levels of post-translationaly modified histone H3 occur during their activation, which differ between early- and late-firing origins. Late origins have a compact chromatin structure during S phase, which transiently opens during their activation, whereas early origins display histone modifications associated with open chromatin structure, which is only passively affected during their activation by passage of the replication fork. === La réplication de l’ADN commence aux origines de réplication et nécessite l’assemblage méthodique du complexe pré-réplicatif (pre-RC), qui consiste des protéines ORC1-6, Cdc6, Cdt1 et MCM2-7. L’hétérodimer Ku (Ku70/Ku80) a été précédemment impliqué dans l’assemblage du pre-RC, mais le mécanisme de cette action est inconnu jusqu’à présent. Ici, Ku est montré former un complexe avec la topoisomérase IIβ (topo IIβ), tant in vitro qu’in vivo et le conduire aux origines de la réplication. L’activité enzymatique de topo IIβ crèe de brisures transitoires et specifiques aux origines, lesquelles affectent la topologie de l’ADN pendant l’assemblage du pre-RC. L’inhibition pharmacologique de l’activité de topo IIβ tripote avec l’assemblage du pre-RC au niveau du récrutement des protéines ORC, Cdt1 et Cdc45, ayant comme résultat la prolongation de la phase G1. De même, une inhibition de l’expéssion de Ku80 mène à un chargement réduit des proteins du pre-RC sur la chromatine, à une activation réduite des origines de réplication, ainsi qu’ à l’activation d’un contrôle du cycle céllulaire par un mécanisme qui implique une activité réduite de Cdk2. En général, les donnés impliquent Ku dans l’initiation de la réplication de l’ADN par la régulation de la topologie de l’ADN et suggèrent une réciprocité entre les machinéries de la réplication de l’ADN et du cycle cellulaire. L’assemblage du pre-RC est suivi du récrutement de la machinérie réplicative, qui initie la réplication de l’ADN. Une étude de la structure de la chromatine des origines de la réplication humaines lamin B2 et hOrs8, ainsi que celle du singe Ors8, a montré des changements dynamiques aux niveaux des histones H3 modifiés qui ont lieu pendant leur activation et lesquelles diffèrent entre les origines qui sont actives tôt et tard dans la phase S. Les dernières possèdent une structure de chromatine qui est co