Synthesis and gene silencing activity of ribonucleic acid duplexes containing 3'-deoxy-3'-thiothymidine

• Main Author: Isaac, Siara
• Other Authors: Masad J Damha (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2009
• Subjects: Chemistry - Organic
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=32408

This thesis reports the first synthesis and biophysical characterization of oligoribonucleotides (RNA) containing 3'-deoxy-3'-thiothymidine (3'-S-dT) units. Optimized conditions for incorporating 3'-S-dT into 21-nt RNA strands is also reported. The impact of 3'-S-dT substitutions on the structure and stability of RNA:RNA duplexes was investigated by circular dichroism (CD) and UV/thermal (Tm) studies. Generally, replacement of the 3'-oxygen by a sulphur atom resulted in a significant decrease in the thermal stability of the duplex and strong positional effects were observed. No significant disruption of the A-form helical structure of the duplexes was detected by CD, although in some cases 3'-S-dT inserts led to a reduction in base-base stacking and/or local distortion of the duplex. Assays revealed that short interfering RNA (siRNA) duplexes containing 3'-S-dT on the guide strand were not efficient at down-regulating gene products, but those containing 3'-S-dT on the passenger strand OR on both strands exhibited activities that often surpassed those of unmodified siRNA duplexes. Substitutions at the scissile phosphate position of the passenger strand suggest that the non-bridging 3'-oxygen is not involved in the coordination of a metal ion during the rate determining step in RISC-induced RNA cleavage. === Cette thèse présente la première synthèse et caractérisation biophysique d'oligoribonucleotides (ARN) contenant des unités de 3'-deoxy-3'-thiothymidine (3'-S-dT). Des conditions optimisées pour l'intégration de 3'-S-dT en 21-nt ARN sont aussi présentées. L'impact de la substitution de 3'-S-dT sur la structure et la stabilité des duplex ARN:ARN fut recherché systématiquement par l'entremise de dichroïsme circulaire (CD) et d'études UV/thermale (Tm). Généralement, le remplacement du 3'-oxygène par un atome de sulfure résulta en une baisse significative de la stabilité thermique du duplex, et des effets de positionnement important furent observés. Aucune disruption significative de la structure hélicoïdale A-form du duplex ne fut détectée par le CD, quoi que parfois des inserts de 3'-S-dT entraînèrent une réduction des interactions base-base et/ou une distorsion locale du duplex. Des essaies révélèrent que des duplex interférents d'ARN court (siRNA) contenant du 3'-S-dT sur le brin guide n'ont pas baissé la production de gènes, mais que celles contenant du 3'-S-dT sur le brin complémentaire OU sur les deux brins présentèrent des activités qui fréquemment surpassaient celles de duplex non-modifiés de siRNA. Les substitutions à la position phosphate de rupture du brin complémentaire suggèrent que l'étape déterminante du clivage par RISC n'implique pas le 3'-oxygène pour la coordination d'un ion de métal.