Characterization of met receptor tyrosine kinase-mediated endocytosis and its role in signal transduction and cellular migration

• Main Author: Parachoniak, Christine
• Other Authors: Morag Park (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2012
• Subjects: Biology - Molecular
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=106403

The Met receptor tyrosine kinase (RTK) and its ligand, hepatocyte growth factor (HGF) are potent regulators of epithelial remodeling, dispersal, and invasion and their deregulation is frequently observed in human cancers. These processes are coordinated through signal transduction pathways activated downstream of Met. In turn, it is now understood that an important aspect of signalling outcome is modulated through RTK downregulation via receptor internalization, degradation and also RTK recycling to spatially restricted subcellular domains. Although a strong relationship between RTK endocytosis and signalling had been established prior to this thesis, the precise mechanism(s) of how this is achieved is still poorly understood and little was known for the Met RTK.To address this specifically for the Met RTK, I have characterized the function of two endocytic proteins in Met RTK trafficking and the consequence for biological response. Work in this thesis shows that following HGF-mediated Met activation, the endocytic adaptor protein, Eps15, is recruited to the Met receptor, and becomes both tyrosine-phosphorylated and ubiquitinated. Recruitment of Eps15 requires Met receptor kinase activity and involves two distinct Eps15 domains. Unlike previous reports for other receptors, recruitment of Eps15 to Met involves a distinct mode of recruitment involving the coiled-coil domain of Eps15 and the signaling adaptor molecule, Grb2. This identified a new mechanism of recruitment for Eps15 downstream of the Met receptor.In the third part of my thesis, I establish that the endocytic adaptor molecule, Golgi-localized gamma-ear containing Arf-binding protein 3 (GGA3), interacts selectively with Met when stimulated by HGF, to sort Met for recycling through a Rab4 positive compartment rather than degradation. I provide evidence supporting a molecular mechanism through which GGA3 regulates Met recycling and demonstrate that this is essential for both prolonged signaling and HGF-mediated biological response. This data defines an active recycling pathway involving GGA3, and supports a broader role for GGA3-mediated cargo selection in targeting receptors destined for recycling.Finally, in the fourth chapter of this thesis, evidence for microtubule interactions in Met-mediated Rab4 vesicle recycling is presented. We characterize a mechanism reliant on the microtubule +TIP, CLIP-170, linking Met/Rab4-positive recycling vesicles to microtubules for transport to the lamellipodia. We propose that the specific targeting of the Met receptor to the leading edge functions as a specialized signalling microenvironment, required for maintaining normal migration dynamics. These studies identify Met RTK endocytosis as a crucial regulatory process for RTK signalling and biology and stress the need for further studies examining the interplay of RTK endocytosis and signalling in the context of normal development and cancer settings. === Le récepteur tyrosine kinase (RTK) Met, ainsi que son ligand, le facteur de croissance des hepathocytes (HGF), sont de puissants régulateurs du remodelage, de la dispersion et de l'invasion des cellules épithéliales, et leur dérèglement est fréquemment observé dans divers types de cancers chez l'humain. Ces processus sont coordonnés par l'activation de voies de signalisation induites par Met. Il est maintenant connu que l'internalisation, la dégradation ainsi que le recyclage des RTKs vers des domaines spécifiques de la cellule constituent des facteurs importants influençant les conséquences de l'activation de ces voies de signalisation. Bien que le lien entre l'endocytose et la signalisation des RTKs ait été démontré avant ce mémoire, les mécanismes spécifiques de cette association restent encore mal compris. Pour aborder ce problème spécifiquement concernant le récepteur Met, j'ai caractérisé les rôles de deux protéines endocytiques impliquées dans le trafic de Met, et leur implication dans les réponses biologiques induites par Met. Les travaux présentés dans ce mémoire montrent qu'en réponse à l'activation de Met par HGF, l'adaptateur endocytique Eps15 est recruté par le récepteur et devient tyrosine phosphorylé et ubiquiné. Le recrutement d'Eps15 requiert l'activation du récepteur tyrosine kinase Met, et implique deux domaines distincts d'Eps15. Contrairement à ce qui a été rapporté pour d'autres récepteurs, le recrutement d'Eps15 par Met met en jeu un mode de recrutement distinct impliquant le faisceau d'hélices (coiled-coil domain) d'Eps15 et l'adapteur signalétique Grb2. Ceci a permis d'identifié un nouveau mécanisme de recrutement d'Eps15 par le récepteur Met.Dans la troisième partie de ce mémoire, j'ai établi que l'adaptateur endocytique Golgi-localized gamma-ear containing Arf-binding protein 3 (GGA3) interagit spécifiquement avec Met lorsque celui-ci est stimulé par HGF. En conséquence, GGA3 trie Met pour le recyclage via un compartiment contenant Rab4, plutôt que de le trier pour être dégradé. J'y démontre un nouveau mécanisme moléculaire par lequel GGA3 contrôle le recyclage de Met, ce qui est essentiel pour la signalisation prolongée de Met et des réponses biologiques induites par HGF. Ces données définissent un nouveau mécanisme de recyclage actif impliquant GGA3 et supportent un rôle plus large joué par GGA3 dans la sélection des récepteurs destinés au recyclage.Finalement, le rôle des microtubules dans le recyclage des vésicules contenant Rab4 induit par Met est présenté dans le quatrième chapitre de ce mémoire. Nous avons caractérisé un mécanisme dépendant d'une protéine de l'extrémité (+TIP), CLIP-170, qui lie les vésicules de recyclage contenant Met et Rab4 aux microtubules, contrôlant ainsi leur transport vers les lamellipodes. Nous proposons que le ciblage spécifique du récepteur Met vers le front de migration fonctionne comme un microenvironnement signalétique spécifique requis pour le maintient de la dynamique migratoire. Ces travaux ont permis d'identifié l'endocytose du récepteur tyrosine kinase Met comme étant un processus de régulation cruciale pour la signalisation des RTK et pour les réponses biologiques associées à cette signalisation. Ces travaux démontrent qu'il y a un besoin important d'examiner la relation entre l'endocytose des RTKs et leur signalisation aussi bien dans le contexte du développement normal que dans le cadre du développement cancéreux.