Melhoramento da fermentação alcoólica em Saccharomyces cerevisiae por engenharia evolutiva.

• Main Author: Thiago Olitta Basso
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2011
• Subjects: Saccharomyces; Combustíveis líquidos; Etanol; Fermentação alcoólica; Leveduras; Sacarose; Alcoholic fermentation; Ethanol; Liquid fuels; Sucrose; Yeast
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-14092011-153623/

Durante o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae em meios contendo sacarose, a enzima invertase hidrolisa a sacarose no ambiente extracelular em glicose e frutose, as quais são posteriormente captadas pelas células por difusão facilitada. Num trabalho prévio, a localização da enzima invertase foi modificada nesta levedura, eliminando-se a forma extracelular e superexpressando-se a forma intracelular da enzima (Stambuk et al., 2009). Como resultado, a captação de sacarose por esta linhagem modificada (iSUC2) é realizada pelo co-transporte ativo com íons H+, implicando no gasto de 1 mol de ATP para cada mol de H+ extrudado pelas células para manutenção do pH intracelular. Como forma de compensar este gasto energético, espera-se que a linhagem iSUC2 desvie uma maior parte do fluxo de carbono para a geração de energia e, consequentemente, para a formação de etanol, em relação a uma linhagem selvagem. No presente trabalho, uma avaliação fisiológica quantitativa de uma linhagem com esta modificação genética foi realizada tanto em quimiostatos limitados por sacarose, como em cultivos descontínuos com sacarose como única fonte de carbono. Os dados obtidos em quimiostatos anaeróbios demonstram que na linhagem iSUC2 a enzima invertase ficou retida no ambiente intracelular e apresentou atividade absoluta total cerca de duas vezes maior que na linhagem-referência (SUC2). Além disto, verificou-se um aumento de 4% no fator de conversão de sacarose a etanol (Y ETH/S), em relação à linhagem SUC2. No entanto, como foi observado que cerca de 8 % da sacarose não foi consumida pelas células da linhagem iSUC2 durante o estado-estacionário dos quimiostatos anaeróbios, decidiu-se melhorar a capacidade do transporte ativo deste dissacarídeo nesta linhagem através de uma estratégia de engenharia evolutiva caracterizada pelo cultivo destas células em quimiostatos longos limitados por sacarose, em anaerobiose. Obteve-se assim, após cerca de 60 gerações, uma linhagem mutante (iSUC2 evoluída) com atividade de transporte de sacarose 20 vezes superior à linhagem iSUC2, sendo capaz de consumir toda a sacarose do meio de cultivo. Esta linhagem apresentou um aumento de 11% no YETH/S e uma diminuição de 27% no fator de conversão de sacarose a células (YX/S), quando comparada à linhagem-referência. A análise do transcriptoma revelou o aumento da expressão de vários genes codificadores de transportadores de hexoses, bem como genes relacionados ao metabolismo de maltose, incluindo o gene do transportador de alta-afinidade para alfa-glicosídeos AGT1, quando a linhagem iSUC2 evoluída foi comparada à linhagem iSUC2. Detectou-se que a evolução em quimiostato resultou na duplicação do gene AGT1, sem que houvesse mutação neste gene. Através da superexpressão do gene AGT1 na linhagem iSUC2, conseguiu-se gerar uma linhagem que apresentou YETH/S muito próximo ao da linhagem iSUC2 evoluída. No entanto, outros parâmetros fisiológicos, foram diferentes nestas duas linhagens, indicando que a duplicação do gene AGT1 não foi a única mutação que ocorreu durante o processo de evolução em quimiostato. Este trabalho ilustra o potencial da combinação entre engenharia metabólica e engenharia evolutiva para a obtenção de linhagens de levedura melhoradas, para aplicação na produção industrial de etanol combustível a partir de meios contendo sacarose. === When growing on sucrose-containing substrates, Saccharomyces cerevisiae secretes invertase that hydrolyses sucrose into glucose and fructose, which are subsequently assimilated by facilitated diffusion. In a previous work, the cellular location of invertase in yeast was modified, by eliminating the extracellular form of the enzyme and over-expressing the intracellular one (Stambuk et al., 2009). As a result, sucrose uptake by this modified strain (iSUC2) occurs by an active H+-sucrose symport system, in which 1 ATP needs to be used by the cells to extrude the proton co-transported. In order to compensate for this, it is expected that these cells will deviate a higher proportion of the carbon flow towards energy generation, and consequently to ethanol formation, in comparison with the wild-type phenotype (SUC2). In the present work, a quantitative physiological evaluation of the iSUC2 strain was performed in both batch and chemostat cultures. Cells from the iSUC2 strain harvested from steady-state anaerobic sucrose-limited chemostats retained all invertase intracellularly and showed a 2-fold higher total invertase activity, when compared to the SUC2 strain grown under identical conditions. Besides this, the ethanol yield on sucrose in the former cells was 4% higher than in the latter case. However, due to the high levels of residual sucrose during these cultivations with the iSUC2 strain, we attempted to improve the transport capacity in the iSUC2 strain by evolutionary engineering. After 60 generations of cultivation in an anaerobic sucrose-limited chemostat, an evolved strain was selected, which presented a 20-fold increase in the sucrose transport capacity, when compared with the parental strain (iSUC2), leading to almost no residual sucrose. During growth of this evolved strain in anaerobic sucrose-limited chemostats, the ethanol yield on sucrose was 11% higher and the biomass yield on sucrose was 27% lower, when compared with the SUC2 strain. Transcriptome analysis revealed an increase in the expression level of several hexose transporters, as well as many MAL-related genes, including the gene for the high-affinity permease AGT1. Indeed, it was verified that this gene was duplicated during the evolution experiment, but no point mutation was detected. By over-expressing the AGT1 gene in the iSUC2 strain, it was possible to attain a similar ethanol yield on sucrose, when compared to the evolved iSUC2 strain. However, several other physiological parameters were different in both strains, indicating that the AGT1 gene duplication was not the only mutation that occurred during evolution in the chemostat. To conclude, this work illustrates that the combination of metabolic and evolutionary engineering is a powerful strategy to obtain improved sucrose-fermenting yeast strains.