Estudo da capacidade antioxidante do polifenol ácido elágico in vitro e em Saccharomyces cerevisiae selvagem e deficiente em superóxido dismutase 1

• Main Author: Dalvi, Luana Taquette
• Other Authors: Lima, Marcelo Hermes
• Language: Portuguese
• Published: 2015
• Subjects: Antioxidantes; Ferro; Leveduras; Polímeros
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/17505

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Doutorado em Nutrição Humana, 2014. === Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva ([e-mail]) on 2015-01-27T18:05:17Z No. of bitstreams: 1 2014_LuanaTaquetteDalvi_Parcial.pdf: 576296 bytes, checksum: 077c7602441bff2e15ecf9b69e65f019 (MD5) === Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva([e-mail]) on 2015-01-30T15:52:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LuanaTaquetteDalvi_Parcial.pdf: 576296 bytes, checksum: 077c7602441bff2e15ecf9b69e65f019 (MD5) === Made available in DSpace on 2015-01-30T15:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LuanaTaquetteDalvi_Parcial.pdf: 576296 bytes, checksum: 077c7602441bff2e15ecf9b69e65f019 (MD5) === O ácido elágico (AE) é um polifenol presente em frutas vermelhas e castanhas que tem sido estudado nas últimas duas décadas devido suas propriedades antioxidante, antimutagênica e anticarcinogênica. Apesar disso, ainda não se sabe ao certo como seria o mecanismo antioxidante do AE in vitro ou in vivo. Portanto, nós primeiramente investigamos a capacidade do AE de quelar íons Fe3+ na presença de diferentes ligantes de ferro (EDTA, citrato e NTA). O mecanismo quelante do AE foi correlacionado com sua atividade antioxidante. O AE apresenta uma pequena proteção contra a degradação da 2-desoxiribose induzida por Fe3+-EDTA e ascorbato, alcançando apenas 12% de proteção com 50 μM de AE. Entretanto, ao utilizar citrato ou NTA, ligante que formam complexos mais fracos com o Fe3+, a proteção aumenta para 80% e 45%, respectivamente. Além disso, o efeito antioxidante do AE é depende do tempo de pré-incubação na presença de uma razão 1:1 de Fe3+-EDTA, o que sugere novamente mecanismo quelante. AE apresenta uma maior inibição da taxa de consumo de oxigênio na presença de Fe3+-citrato do que na presença de Fe3+-EDTA. Nossos resultados estão de acordo com os espectros de formação do complexo ferro-AE, os quais demonstram que o AE remove Fe3+ do EDTA de forma mais lenta do que na presença de citrato (1h x 1 min, respectivamente). Essa diferença na taxa de complexação pode explicar o efeitoantioxidante encontrado nesses sistemas. Em seguida, nós analizamos o efeito do AE contra o estresse induzido por menadiona em linhagens de levedura selvagem (WT) e deficiente em SOD1 (Δsod1). Em condição controle, sem a adição de menadiona, AE melhora a viabilidade da linhagem Δsod1 de forma dose dependente. Além disso, o tratamento com 50 μM de AE em ambas as linhagens WT e Δsod1 aumenta a viabilidade da célula incubada com menadiona. O estresse induzido pela menadiona aumenta, em 10 vezes, os níveis de GSSG da linhagem Δsod1 (devido a oxidação de GSH) enquanto que nenhum efeito é observado na linhagem selvagem. A administração de AE aumenta os níveis de glutationa total nas duas linhagens (60-90% de aumento), assim como promove diminuição na formação de GSSG na levedura Δsod1 tratada com menadiona. A atividade de enzimas antioxidantes como GPx e GR são afetadas pelo tratamento com menadiona e pela suplementação com AE. Como já era de se esperar, a atividade GPx está aumentada na linhagem Δsod1 quando comparado com a WT. Atividade GR, por outro lado, está significativamente aumentada na presença de menadiona e AE. Atividade aconitase é conhecida como sensor da presença de radical superóxido na célula, uma vez que esse radical remove o íons de ferro do seu sítio ativo, inativando a enzima. Tratamento com menadiona diminui a atividade aconitase da linhagem Δsod1, que não é previnida pela suplementação com AE. Aparentemente, essas linhagens de levedura apresentam um controle rigoroso da integridade de membrana, uma vez que análises em FACS mostraram que não há alterações relevantes na permeabilidade de membrana após tratamento com menadiona em ambas as linhagens. Mais ainda, análises por HPLC não detectaram mudanças nos níveis de peroxidação lipídica ou mesmo na concentração de ergosterol. Ao todo, os resultados sugerem que que o AE apresenta efeito protetor contra o estresse induzido por menadiona evidenciado pela melhora da viabilidade celular e pela prevenção da oxidação de GSH. Nossos resultados também demonstram que o AE é capaz de modular a atividade de enzimas antioxidantes induzindo o sistema antioxidante endógeno da levedura. === Ellagic acid (EA) is a polyphenol present in berries and nuts that has been subject of research over the past two decades due to its antioxidant, antimutagenic and anticarcinogenic properties. Despite that, it is still unclear its antioxidant mechanism in vitro and in vivo. With this in mind, we first investigated the capacity of EA to chelate Fe3+ ions in the presence of different iron ligands (EDTA, citrate and NTA). The chelating mechanism of EA was then correlated to its antioxidant activity. EA has a small protection against 2-deoxyribose degradation induced by Fe3+-EDTA and ascorbate, reaching only 12% of protection with 50 μM EA. However, using citrate or NTA, ligands that are known to form weaker complexes with Fe3+, the protection increases to 80% and 45%, respectively. In addition, the antioxidant effect of EA is dependent on the pre-incubation period only when employing a 1:1 Fe3+-EDTA, suggesting again a chelating mechanis. EA presents a better inhibitory effect on the oxygen consumption rate in the presence of Fe3+-citrate when compared to Fe3+-EDTA. Our results are in agreement with spectroscopic analyses of iron-EA complexes, which demonstrate that EA removes Fe3+ from EDTA slower that from citrate (1 h and 1 min, respectively). The difference in the complexation rate could help explaining the antioxidant effects of EA in these systems. We then analyzed the effects of EA against a menadione-induced oxidative stress using both wild-type (WT) and SOD1 deficient (Δsod1) yeast strains. Under control conditions, in the absence of menadione, EA already improves Δsod1 viability in a dose-dependent manner. Moreover, the treatment with 50 μM EA in both WT and Δsod1 strains increases their viability when incubated with menadione. The stress caused by menadione increases, by 10 fold, the GSSG levels in Δsod1 strain (due to GSH oxidation), while no effect is observed in the WT strain. Supplementation with EA, on the other hand, induces an increase in the levels of total-GSH in both strains (by about 60%-90%) as well as it induces a decrease in GSSG formation in the Δsod1 strain stressed with menadione. The activity of antioxidant enzymes such as GPx and GR are affected by menadiona treatment and by supplementation with EA. Not surprisingly, GPx activity is increased in the Δsod1 strain when compared to the WT. GR activity, on the other hand, is significantly increased in the presence of both menadione and EA. Aconitase activity is a known sensor of the presence of superoxide radicals in the cell, since it removes iron ions from the active site, inactivating the enzyme. Treatment with menadione led to a decrease in the aconitase activity in the Δsod1 strain, which is not prevented by the supplementation with EA. Apparently, these yeast strains have a strict control of the membrane integrity, since FACS analyses showed no relevant alterations after menadione treatment in both strains. Moreover, HPLC experiments did not detect major changes in lipid peroxidation levels or ergosterol concentration in both strains Altogether, these results suggest that EA presents protective effects against menadione-induced oxidative stress, which were demonstrated by the improvement of cell viability and the prevention of GSH oxidation. Our results also demonstrate that EA can modulate the activity of antioxidant enzymes, improving the endogenous antioxidant system.