| Summary: | Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1
5633.pdf: 1339694 bytes, checksum: c96c2cb2d5b7dcda944ea18353c62f47 (MD5)
Previous issue date: 2013-08-02 === The Meat tenderness, a trate of economic importance in animal production, is influenced by the intensity of the degradation of myofibrillar proteins in post-mortem. The μ-calpain is the main enzyme responsible for meat tenderness of skeletal muscle, and, conversely, the calpastatin, which is encoded by the CAST gene, acts as endogenous inhibitor of calpain and thus decreases the extent of proteolysis in skeletal muscle. Polymorphisms in CAST were associated with enzyme activity and shear force, indicating the great importance of the study of CAST gene regulation. It is known that the transcription of most genes is stably suppressed in most tissues and only remains active in their tissue of expression and in certain developmental stages, and that can be controlled by epigenetic events such as methylation of DNA cytosine that is identified by sequencing of bisulfite-treated DNA. The aim of this study was to evaluate if there was preferential expression, of tissue, genotype and stage of development for the CAST gene in liver, muscle and skin of fetuses and muscle and liver of homozygous and heterozygous adult cattle for the A> G exon 30/3'UTR polymorphism, evaluated by real-time PCR with SYBR ® fluorophore, and to verify if the differential expression is regulated by the methylation status of promoter region. Differential gene expression analyses were normalized to the reference gene RPS-9. When we analyzed the tissue-specific expression in fetuses, the CAST gene was 2 times more expressed in liver than in skin (p <0.05) and almost two times more expressed in liver than in muscle (p <0.05). It was also found that this gene was 1.83 x up regulated in adult muscle when compared to fetal muscle (p <0.05), showing differential expression in the developmental stage. Differences in expression between genotypes were also found, when comparing the homozygous genotype to the heterozygous genotype (used as calibrator). Fetal samples of muscle and skin of individuals with GG genotype presented higher expression (p <0.05) of CAST gene (2x and 1,74 x, respectively, compared to heterozygous) and muscle of animals with AA genotypes also presented higher expression (1.4x compared to AG). In adult animals, the gene was up regulated in liver and muscle of individuals with GG genotype (2x and 1.63x more than AG, respectively) and was less expressed in the liver of homozygote AA (0,32x less than AG) (p <0.05). The presence of a CpG island in the promoter region of the gene CAST was identified and the methylation status was studied after bisulfite treatment, cloning of the fragment and sequencing of clones. The CpG island was hypomethylated in different tissues: 0.63% of methylated CpG dinucleotides in fetal muscle, 0.43% in fetal liver and 0.61% in adult muscle. According to the different genotypes the island was methylated in 0.61%, 0 49%, 0.60% in animal with AA genotype, 0.81%, 0.35%, 0.34% in AG, 0.4%, 0.45% ,0.9% in GG in fetal muscle, fetal liver and adult muscle respectively. In our results we show that the CpG island is hypomethylated and can allow transcription of the gene but the methylation does not explain the differences in expression within tissues, developmental stage and genotypes of the CAST gene. === A maciez da carne, uma característica de grande interesse econômico, é influenciada pela intensidade da degradação de proteínas miofibrilares no período pós-mortem. A μ-calpaína é a principal enzima responsável pelo amaciamento do músculo esquelético, e de maneira oposta, a calpastatina que é codificada pelo gene CAST, atua como inibidor endógeno das calpaínas e, portanto, diminui a taxa e extensão da proteólise no músculo esquelético. Polimorfismos no gene CAST já foram associados à atividade da enzima e à força de cisalhamento, indicando a grande importância no estudo da regulação desse gene. Sabe-se que a transcrição da maior parte dos genes é reprimida estavelmente na maioria dos tecidos e só permanece ativa nos seus tecidos de expressão e em determinados estádios do desenvolvimento, e que isso pode ser controlado por eventos epigenéticos como a metilação de citosinas do DNA, passível de identificação por sequenciamento de DNA tratado com bissulfito. Os objetivos deste estudo foram avaliar se ocorre expressão preferencial de tecido, de genótipo e de estádio do desenvolvimento para o gene CAST em fígado, músculo e pele de fetos e músculo e fígado de animais adultos em bovinos homozigotos e heterozigotos para o polimorfismo A>G no éxon 30/3 UTR por meio de PCR em tempo real com o fluoróforo SYBR®. Além disso, foi verificado se a expressão diferencial do gene é regulada pelo status de metilação no seu promotor. Todas as expressões foram normalizadas para o gene referência RPS-9. Em fetos o gene CAST foi duas vezes mais expresso (p<0,05) em fígado do que em pele e quase duas vezes mais expresso (p<0,05) em fígado do que em músculo. Também foi encontrado aumento na expressão do gene de 1,83 x (p<0,05) em músculo adulto quando comparado a músculo fetal, evidenciando expressão diferencial de estádio de desenvolvimento. Quando analisadas as diferenças de expressão entre genótipos, comparando o genótipo homozigoto com o genótipo heterozigoto (usado como calibrador) foi encontrado, em amostras de fetos, um aumento de expressão (p<0,05) do gene CAST em músculo e pele de indivíduos GG (2x e 1,74x, respectivamente, em relação a heterozigotos) e músculo de indivíduos AA (1,4x em reação a AG). Em amostras de animais adultos, o gene foi mais expresso em fígado e músculo de indivíduos GG (2x e 1,63x mais que AG, respectivamente) e foi menos expresso (p<0,05) em fígado de indivíduos homozigotos AA (0,32x menos que AG). Foi identificada a presença de uma ilha CpG na região promotora do gene CAST e foi realizado tratamento do DNA com bissulfito, a clonagem do fragmento e o sequenciamento de clones. A ilha CpG mostrou-se hipometilada nos diferentes tecidos: 0,63% de dinucleotídeos CpG metilados em músculo fetal, 0,43% em fígado fetal e 0,61% em músculo adulto; e nos diferentes genótipos: 0,61%, 0,49% e 0,60% em AA, 0,81%, 0,35%, 0,34% em AG, 0,4%, 0,45% e 0,9% em GG em músculo fetal, fígado fetal e músculo adulto respectivamente. Assim a hipometilação da ilha CpG pode permitir a transcrição do gene, mas não explica as diferenças de expressão entre tecidos, estádio de desenvolvimento e genótipo para o genes CAST.
|
|---|
