Imobilização enzimática para a determinação de peróxido de hidrogênio, catalase e avaliação in vitro da atividade antibacteriana em amostras de mel

• Main Author: Franchini, Rômulo Augusto de Abreu
• Other Authors: Matos, Renato Camargo
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) 2017
• Subjects: CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA; Mel; Peróxido de hidrogênio; Enzima imobilizada; Catalase; Atividade antibacteriana; Honey; Hydrogen Peroxide; Immobilized Enzyme; Antibacterial Activity
• Online Access: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/4443

Submitted by Renata Lopes ([e-mail]) on 2017-05-09T14:17:11Z No. of bitstreams: 1 romuloaugustodeabreufranchini.pdf: 12314039 bytes, checksum: fcf7a0798691ae32d15114b47607205e (MD5) === Approved for entry into archive by Adriana Oliveira ([e-mail]) on 2017-05-17T14:14:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 romuloaugustodeabreufranchini.pdf: 12314039 bytes, checksum: fcf7a0798691ae32d15114b47607205e (MD5) === Made available in DSpace on 2017-05-17T14:14:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 romuloaugustodeabreufranchini.pdf: 12314039 bytes, checksum: fcf7a0798691ae32d15114b47607205e (MD5) Previous issue date: 2010-08-04 === CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais === O mel é uma mistura complexa constituída de carboidratos, enzimas, aminoácidos, minerais, ácidos orgânicos e flavonóides. Inúmeros trabalhos evidenciam o potencial terapêutico do mel, o qual suas principais propriedades são a atividade antimicrobiana e ação cicatrizante, sendo estas atribuídas a fatores como acidez, osmolaridade, peróxido de hidrogênio (H2O2), catalase e flavonóides. A primeira pesquisa deste trabalho consistiu na determinação da origem floral das amostras de mel, realizada através da análise microscópica do pólen (melissopalinologia). Os espectros demonstraram a variabilidade polínica das amostras escolhidas. Em outro estudo, dois métodos versáteis, envolvendo a espectrofotometria e amperometria, foi aplicado na determinação dos teores de H2O2 em 17 amostras de mel. O H2O2 foi determinado por análise de injeção em fluxo (FIA) e reatores tubulares contendo a enzima peroxidase imobilizada na resina Amberlite IRA-743. A determinação espectrofotométrica baseouse na oxidação do H2O2 pela enzima na presença de fenol e 4-aminoantipirina e o complexo anti-pirilquinonimina gerado, foi proporcional a concentração de H2O2. Na determinação amperométrica, um eletrodo de ouro eletrodepositado com platina, eletrodo de Ag/AgCl(sat) (+ 0,60V) e uma agulha de aço inoxidável foram utilizados como eletrodos de trabalho, referência e auxiliar, respectivamente. O método baseou-se em três medidas no sistema FIA e a diferença entre os sinais revelou a corrente proporcional de H2O2 no mel. Ambos os métodos apresentaram ampla faixa de linearidade (0,5 a 100 µmol L−1) e baixos limites de quantificação e detecção. As concentrações encontradas ficaram entre 4 e 214 µg g-1. A determinação de H2O2 provou a rapidez, exatidão e sensibilidade dos métodos quando associados aos sistemas FIA. Em outro trabalho, um sensor amperométrico para a determinação da catalase (CAT), acoplado ao sistema FIA e reatores tubulares foi desenvolvido. A quantificação fundamentou-se em 2 etapas de injeção: (1) padrão de H2O2 e (2) padrão de H2O2 tratado com a CAT imobilizada na Amberlite IRA-743. A diferença da corrente entre (1) e (2) mostrou o consumo de H2O2 por unidade de enzima imobilizada O mesmo procedimento foi aplicado para as amostras de mel e a linearidade da curva para a determinação da CAT ficou entre 100 e 5000 UI mL-1. Os níveis de CAT variaram de 9 a 99 UI mg-1. Os resultados demonstraram uma boa relação inversa entre os teores de CAT e H2O2. O último estudo avaliou, in vitro, a atividade antibacteriana contra 18 linhagens de bactérias Gram positivas e negativas. O screening antimicrobiano foi determinado aplicando testes de difusão em ágar e diluição em caldo, exibindo as concentrações inibitórias mínimas, conforme recomendações da CLSI. Concentrações de mel variando entre 1 e 30% (v/v) foram estudadas e 5 amostras apresentaram atividade bacteriostática, especialmente contra S. aureus, S. epidermidis e E. coli. Os resultados reforçaram a idéia da utilização do mel como agente antimicrobiano e enfatizaram que o H2O2 não é o único inibidor de crescimento bacteriano, mas sim um dos constituintes com atividade bacteriostática e bactericida. === Honey is a complex mixture of carbohydrates, amino acids, minerals, organic acids and flavonoids. The therapeutic potential of honey is gradually growing and its scientific evidences of effectiveness. Honey has been reported as antimicrobial agent, to promote healing wound and burns and the antibacterial activity is attributed to factors such as acidity, osmolarity, hydrogen peroxide (H2O2), catalase and flavonoids. The first research of this work involved the determination of the floral origin of honey which was achieved by microscopic analysis of the pollen (melissopalynology). The pollen spectrum showed the pollinic variety corresponding to different taxonomic levels. In the other study, two versatile methods involving spectrophotometry and amperometry were applied for the determination of H2O2 in 17 commercial honey samples. H2O2 was determined by flow-injection analysis (FIA) with a tubular reactor containing peroxidase enzyme immobilized on Amberlite IRA-743 resin. The spectrophotometric determination was based on the oxidation of H2O2 by the enzyme in presence of phenol and 4aminoantipirine. The rate of color generation, due to the formation of the antipyrilquinonimine species was proportional to the concentration of H2O2. In the amperometric determination, a gold electrode modified by electrochemical deposition of platinum, an Ag/AgCl(sat) electrode (+ 0.60V) and a stainless steel tube were employed as working, reference and auxiliary electrodes, respectively. This method was based on three measurements in the FIA system and the difference between peaks showed the proportional current of H2O2 in the honey samples. Both methods showed wide linear dynamic range for H2O2 (0.5 to 100 µmol L−1) and low quantification/detection limits. The concentrations found in the analyzed honeys samples were in the range of 4-214 µg g-1 of H2O2. The determination of H2O2 showed the rapidness, accuracy and sensitivity provided by the two methods, while combined with the FIA system. An amperometric sensor for catalase (CAT) detection in association with FIA system and a tubular reactor containing Amberlite IRA-743 was developed. Catalase quantification was based on two injections: (1) H2O2 standard solution and (2) H2O2 standard solution treated with CAT immobilized on Amberlite IRA-743. The difference between the current obtained from (1) and (2) showed the consumption of H2O2 per unit of enzyme immobilized. The same procedure was used to immobilize CAT in honey samples. The linear dynamic range for CAT extends from 100 to 5000 UI mL-1. The levels of CAT vary from 9 to 99 UI mg-1. Taking into account these results, an inverse correlation was obtained between CAT and H2O2 levels. Finally the antibacterial evaluation of honeys samples against 18 bacterial strains including Gram-negative/positive species was studied. The screening of antimicrobial potential was determined using the drop-test agar diffusion and the broth diluiton methods according to the CLSI recommendations. Increasing honey concentrations, varying from 1 to 30% (v/v) were studied and five samples demonstrated bacteriostatic activity against ATCC® S. aureus, S. epidermidis and E. coli bacterial strains. The results of this preliminary study tend to reinforce the use of honey as antimicrobial agent and emphasize that H2O2 is not the only inhibine present in honey, but it is one of the whole group with bacteriostatic and bactericidal activity.