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Previous issue date: 2014-02-20 === Atualmente existe uma crescente demanda pelo uso de enzimas com aplicação industrial e terapêutica. Dentre a vasta aplicabilidade das enzimas merecem destaque as proteases que representam 60 % do total das enzimas utilizadas no mundo. A bromelina é uma protease com relevância na indústria alimentícia, cosmética, farmacêutica e biotecnológica, de alto valor comercial, que pode ser obtida a partir de resíduos do abacaxizeiro. O Brasil está entre os primeiros produtores mundiais de abacaxi, sendo que os resíduos agrícolas e agroindustriais não tem destino, podendo ser utilizado como fonte de obtenção de bromelina. Este trabalho objetiva desenvolver uma nova metodologia de purificação de bromelina a partir de resíduos do abacaxizeiro cv. (cultivar) Vitória. O trabalho está dividido em quatro capítulos. 1: Foram comparadas as características-físico químicas (Sólidos solúveis totais (SST), acidez titulável (AT) e a razão SST/AT), protéicas e de atividade de bromelina entre os frutos das cvs. Vitória e Pérola em diferentes estádios de maturação, e constatado que a cv. Vitória (resistente à fusariose) apresenta características semelhantes ou superiores à cv. Pérola, o que contribui para sua aceitação pelo mercado consumidor e a consequente ampliação do seu cultivo, tornando viável a utilização de seus resíduos como fonte de obtenção de bromelina; 2:Realizou-se uma comparação entre cinco diferentes soluções de extração de bromelina (H2SO4/ Na2SO4 pH 4,5; Tampões acetato pH 3,6; 4,0 e 5,0 e tampão fosfato pH 7) e entre dois métodos de precipitação fracionada (acetona gelada e sulfato de amônio) e diferentes cromatografias de troca iônica (DEAE-celulose, SP-Sepharose e CM-Celulose). A solução de extração H2SO4/Na2SO4 pH 4,5 apresentou o maior rendimento de proteínas totais e atividade proteolítica e atividade específica. Na precipitação fracionada, as frações 20-50 % (F2S) e 50-75 % (F3S) de saturação por sulfato de amônio renderam maiores valores de atividade proteolítica com 88,57 % e 98,42 % respectivamente, quando comparadas à precipitação por acetona gelada. Durante a purificação, a fração F3S foi aplicada em diferentes resinas de troca iônica e observou-se que aCMC manteve os valores de atividade proteolítica mais elevados (89,31%); 3: Uma nova metodologia de purificação foi desenvolvida utilizando CMC e Sephadex® G-50, obtendo uma bromelina pré purificada (FP 3,01 93% de atividade) e bromelina purificada (FP 16,86 89% de atividade). A pureza da bromelina foi confirmada por SDS-PAGE revelando apenas uma banda em 30 KDa, por HPLC com apenas um pico nos primeiros 10 minutos e, por espectrometria de massas (MALDI-TOF MS) através do Peptidemassfingerprint (PMF) da enzima. Além da fragmentação (MALDI-TOF MS/MS) e sequenciamento de dois peptídeos m/z 951 e 1584; 4:Foi realizado uma caracterização cinética da bromelina pré-purificada e purificada. A bromelina pré-purificada apresenta duas temperaturas ótimas (40 e 60ºC) e um pH ótimo (8) e que a bromelina purificada apresenta temperatura ótima de 60 ºC e pH ótimo de 8. Por fim,é possível afirmar que os resíduos de abacaxi da cv. Vitória foram uma boa fonte de obtenção de bromelina. A metodologia desenvolvida foi inovadora e possibilitou obter bromelina com alto grau de pureza e maior viabilidade de execução por reduzir os passos de sua purificação comparada com as metodologias existentes.
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