| Summary: | Orientadora : Profa. Dra. Luciana Porto de Souza Vandenberghe === Co-orientadora : Profa. Dra. Cristine Rodrigues === Co-orientador : Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol === Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 12/03/2013 === Inclui referências === Área de concentração: Agroindústria e biocombustíveis === Resumo: Os probióticos são micro-organismos vivos que produzem efeitos benéficos à saúde do indivíduo, quando administrados em quantidades adequadas. A maioria são bactérias, sendo a Saccharomyces boulardii uma das leveduras que apresentam propriedades probióticas. O micromineral selênio possui efeitos nutricionais e é um elemento traço essencial necessário para o adequado funcionamento do sistema antioxidante do organismo. Uma das formas mais usadas de suplementação nutricional de selênio é a levedura rica em selênio, fonte rica do selênio orgânico selenometionina, a melhor fonte para os organismos. Todos os produtos existentes no mercado de levedura rica em selênio são produzidos com a levedura S. cerevisiae e os estudos sobre a produção de probióticos são voltados para bactérias, não sendo encontrados estudos sobre a produção biotecnológica da levedura probiótica S. boulardii. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um bioprocesso para a produção de biomassa probiótica S. boulardii e também desta levedura enriquecida com selênio (Se) orgânico, através de fermentação submersa utilizando o subproduto agroindustrial melaço de cana-de-açúcar. Duas cepas de S. boulardii, SbM e Sb4308, passaram pelos estudos de otimização do meio de cultivo. A cepa Sb4308 foi selecionada por apresentar maior produção de biomassa e foi utilizada nos estudos de bioacúmulo de Se. Os crescimentos das cepas a 30?C e 37?C foram comparados, sendo selecionada 30?C como temperatura de cultivo. Iniciou-se a otimização dos componentes do meio de cultivo com um screening de 11 componentes em um Planejamento tipo Plackett & Burman, no qual 5 foram significativos, e seguiram para um planejamento fatorial incompleto 2 (5-2), sendo selecionadas 3 variáveis significativas. A terceira etapa da otimização foi realizada com o suporte de um planejamento do tipo DCCR 23. Neste planejamento tipo DCCR foi encontrada a região ótima das concentrações das variáveis para a cepa SbM, sendo glicose 40 g/L, melaço de cana 50 g/L e extrato de levedura 12 g/L, cuja produção de biomassa foi de 9,66 g/L. Seguiu-se os estudos para a cepa Sb4308 com aumento da concentração da fonte de carbono, pelos quais foram encontradas as condições selecionadas: melaço de cana 150 g/L e extrato de levedura 12 g/L, obtendo-se uma produção de 11,03 g/L de biomassa seca. Após a definição do meio de cultivo e da cepa, foram realizados os estudos das cinéticas de produção do inóculo e da biomassa; os tempos de cultivos determinados foram 20 h e 24 h, respectivamente. Prosseguiu-se com o estudo da fermentação em batelada em biorreator BioFlo? 110, obtendo-se uma produção de 11,37 g/L de biomassa seca, com o cultivo a 30?C, 30% OD, agitação mínima de 300 rpm e pH inicial de 5,5. Posteriormente foram realizados estudos do processo em batelada alimentada em frascos de Erlemeyer e as melhores condições encontradas foram: alimentação no tempo de 4 h com melaço de cana a 100 g/L. Nesta etapa, a produção de biomassa seca foi de 13,18 g/L em 10 h de cultivo, com uma produtividade de 1,32 g/L.h. Obteve-se assim, um aumento de produtividade de 1624% em relação às condições iniciais (0,08 g/L.h em meio YM líquido). Iniciaram-se os estudos de bioacúmulo de Se e os valores ótimos encontrados foram: adição de 100 ppm de Se no cultivo no tempo de 10 h. Foi testada uma adaptação prévia de Sb4308 a concentrações crescentes de Se no meio, para uma comparação entre a cepa selvagem e a cepa adaptada. A cepa selvagem teve um maior crescimento e melhor bioacúmulo. A determinação de Se inorgânico total livre foi realizada através de espectrofotometria da reação colorimétrica com Azure B e a determinação de Se total bioacumulado foi realizada através de espectrofotometria de absorção atômica. Um estudo da cinética de crescimento e bioacúmulo de selênio pela levedura Sb4308 em fermentação em batelada alimentada foi realizado em biorreator BioFlo? 110, obtendo-se uma produção de 12,73 g/L de biomassa seca e 3.053,00 ?g de Se/g de biomassa. Foram iniciados estudos de especiação e quantificação de Se orgânico bioacumulado através de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa. Palavras-chave: Levedura, Saccharomyces boulardii, probiótico, selênio orgânico, fermentação submersa. === Abstract: Probiotics are live microorganisms that produce beneficial effects on the health of the individual, when administered in adequate amounts. Most are bacterias, being Saccharomyces boulardii one of yeasts that have probiotic properties. Selenium has nutritional effects and is an essential trace element necessary for the proper functioning of the body's antioxidant system. One of the most widely used forms of nutritional supplementation of selenium is the yeast rich in selenium, a rich source of the organic selenium selenomethionine, the best source for the organisms. All products on the market of yeast rich in selenium are produced with the yeast S. cerevisiae and studies about the production of probiotics are facing bacterias, did not find studies about the biotechnological production of the probiotic yeast S. boulardii. Thus, the aim of this study was to develop a bioprocess for the production of probiotic biomass Saccharomyces boulardii and also this yeast enriched with organic selenium (Se) through submerged fermentation using the agroindustrial byproduct sugarcane molasses. Two strains of S. boulardii, SbM and Sb4308, passed by the optimization studies of the medium. Sb4308 was selected due to its higher biomass production and has been used in studies of selenium bioaccumulation. The growths at 30?C and 37?C were compared, determining that the cultivation temperature was 30?C. The optimization of the components of the culture medium began with a screening of 11 components in Plackett & Burman design, in which 5 components were significant. Then an incomplete factorial design 2(5-2) was performed, being selected three significant variables. The third step of optimization was performed with the support of a DCCR 23 design. In DCCR was found the optimal region of concentrations of the variables for strain SbM, being glucose 40 g/L, sugarcane molasses 50 g/L and yeast extract 12 g/L, whose biomass was 9.661g/L. Followed studies for Sb4308 strain with increased concentration of carbon source, whereby selected conditions were found: sugarcane molasses 150 g/L and yeast extract 12 g/L, yielding of 11.03 g/L dry biomass. After defining the culture medium and the strain, kinetic studies of the inoculum and biomass production were conducted, and the times were determined for 20 h and 24 h, respectively. Proceeded with the study of the fermentation batch in the bioreactor Bioflo?110, the dry biomass obtained was 11.37 g/L, by cultivating at 30?C, DO 30%, minimum agitation of 300 rpm and pH initial 5.5. Subsequent studies about feed fermentation were conducted in flasks Erlemeyers, being the fed in time of 4 h of sugarcane molasses 100 g/L the best conditions found. At this stage the dry biomass was 13.18 g/L in 10 h of cultive, with a productivity of 1.32 g/L.h. There was thus obtained a productivity increase of 1624% in relation of the initial conditions (0.08 g/L.h in liquid YM medium). Followed then for selenium bioaccumulation studies and the optimum values found were: addition of 100 ppm of Se in cultivation at the time of 10 h. A prior adaptation was tested to Sb4308 in increasing concentrations of Se for a comparison between the wild strain and the adapted strain. The wild strain had higher growth and better bioaccumulation. The determination of free total Se was performed by spectrophotometry of color reaction with Azure B and determination of Se bioaccumulated was performed by atomic absorption spectrophotometry. The study of the kinetics of growth and bioaccumulation of selenium by yeast Sb4308 in the fed-batch fermentation was performed in a bioreactor Bioflo?110, that gave a yield of 12.73 g/L dry biomass and 3053.00 ?g of Se/g biomass. Speciation studies and quantification of organic selenium in biomass were initiated through liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Keywords: yeast, Saccharomyces boulardii, probiotic, organic selenium, submerged fermentation.
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