Bactérias diazotróficas em Guzmania monostachia (Bromeliaceae): identificação, sinalização e colonização dos tecidos foliares

• Main Author: Kleingesinds, Carolina Krebs
• Other Authors: Aidar, Marcos Pereira Marinho
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2016
• Subjects: Bactérias fixadoras de nitrogênio; Bromélia epífita tanque; Nitrogen-fixing-bacteria; Tank epiphytic bromeliad
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41132/tde-29112016-111641/

As bromélias habitam os mais diferentes ambientes sendo que muitas são encontradas como epífitas. Essas últimas estão sujeitas a condições de disponibilidade de água e nutrientes com intermitência. Elas conseguem sobreviver a essas circunstâncias por serem dotadas de diversas adaptações morfológicas e fisiológicas. A bromélia tanque Guzmania monostachia tem sido bastante estudada por possuir uma grande plasticidade fotossintética, porém, pouco é conhecido a respeito de outras possíveis adaptações como a interação com micro-organismos. Sendo assim, o presente trabalho isolou bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) tanto da parte externa (epifíticas) quanto da parte interna (endofíticas) de diferentes porções (ápice, mediana e base) de folhas coletadas tanto no ambiente natural quanto na casa de vegetação. As bactérias foram selecionadas por meio do ensaio de redução de acetileno (ARA) e também pelo uso de quatro diferentes meios de cultura que não contém fonte de nitrogênio reduzido. As linhagens isoladas foram identificadas por meio do gene 16sRNA. Dois isolados Pseudomonas sp. e Burkholderia sp. foram escolhidos para serem marcados com um gene de fluorescência verde (GFP) e foram então inoculados (separadamente) em plantas de G. monostachia cultivadas em casa de vegetação. A colonização dos tecidos foliares foi monitorada com auxílio de um microscópio confocal. Além disso, foram estimadas as densidades populacionais epifíticas e endofíticas em diferentes grupos foliares (jovens e intermediários) e as folhas do grupo intermediário por serem maiores e totalmente expandidas foram divididas em porções (apical, mediana e basal). Também foram pesquisadas as seguintes moléculas descritas como importantes na interação entre planta e micro-organismo: óxido nítrico (NO), ácido salicílico (SA), etileno (ET) e ácido-indol-3-acético (IAA). Como resultados, a maioria das linhagens bacterianas foram classificadas como pertencentes ao grupo Proteobacteria, mas também foram encontrados isolados gram positivos pertencentes aos grupos Actinobacteria e Firmicutes. As bactérias endofíticas foram isoladas somente da porção basal foliar (tanto das folhas originadas do meio ambiente quanto das folhas originadas da casa de vegetação). Cabe ressaltar que após a inoculação de ambas bactérias marcadas com GFP, foi observado elas no interior dos tricomas foliares (estruturas presentes principalmente na base foliar). Após 20 horas da inoculação, ambas bactérias já foram visualizadas no interior da epiderme das folhas. Após 5 dias as bactérias foram se espalhando para regiões mais distantes do tricoma e também foram observadas no parênquima. Após 10 dias a bactéria Pseudomonas sp. foi encontrada nas paredes dos vasos condutores. Foram re-isoladas bactérias epifíticas e endofíticas da mediana e da base foliar, mas não da porção apical. Após 10 dias as bactérias foram isoladas como endofíticas somente da base. Essa porção não apresentou diferenças nas populações epifíticas e endofíticas. O NO aumentou nas folhas jovens e na base das intermediárias em um curto período de tempo após a inoculação. Aparentemente, ambas as bactérias não dispararam a via do SA. De acordo com os resultados aqui presentes, ambas as bactérias não pareceram ser prejudiciais à G. monostachia. Além disso, o presente trabalho mostra fortes evidencias de que as bactérias entram nos tecidos foliares por meio dos tricomas na base foliar e permanecem nessa porção, que é precisamente a mais importante para absorção de nutrientes === Bromeliads inhabit different environments and many are found as epiphytes. These plants are often subjected to periods of water and nutrient shortage. For their survival, epiphytic bromeliads are endowed with different morphological and physiological adaptations. Guzmania monostachia is a tank-bromeliad that has been extensively studied because of its great photosynthetic plasticity. However, little is known about other possible survival adaptations, such as beneficial interactions with microorganisms. Here, we isolated nitrogen fixing (diazotrophc) bacteria from both the outside (epiphytic) and the inside (endophytic) of different leaf portions (apex, middle and base), collected in natural environment and in greenhouse-cultivated plants. The bacteria were selected using the acetylene reduction assay (ARA) and four different media that do not contain reduced nitrogen source. The strains were identified by 16S rRNA. Two isolates, Pseudomonas sp. and Burkholderia sp. has been chosen to be tagged with green fluorescent protein (GFP) and then inoculated in G. monostachia plants cultivated in greenhouse. The colonization of the leaf tissues was monitored with the aid of confocal microscopy and also we estimate the external and internal bacterial population densities in different leaf groups (younger and expanded) and portions (apex, middle and base). In addition, we studied some important molecules in plant-microbe interactions: nitric oxide (NO), salicylic acid (SA), ethylene (ET) and indol-3-acetic acid (IAA). As a result, most of the isolated strains belong to the Proteobacteria group, but gram positive strains were also found belonging to the Firmicutes and Actinobacteria group. The endophytic bacteria were isolated only from the basal portion (both from leaves of natural environment and from leaves of greenhouse cultivated plants). Interestingly, after the inoculation of both bacteria tagged with GFP they were visualized entering by trichomes present mainly in the basal portion. Twenty hours after the inoculation, the bacteria were visualized inside the epidermis of the leaves. After five days, the bacteria were detected in the parenchyma and, ten days after the inoculation Pseudomonas sp. was found on the vessels walls. It was possible to re-isolate epiphytic and endophytic bacteria from the base and middle portions, but not from the apex. After 10 days the endophytic bacteria were found only in the base. The base did not show differences between epiphytic and endophytic populations. NO increased in a short time after the inoculation in the younger leaves and in the basal portion of intermediate leaves. Apparently, the SA pathway was not triggered by any of the bacteria used. According to these results, the bacteria tested do not seem to be harmful to the plant. Furthermore, we strongly suggest that they enter through the trichomes on the leaf base and remain in this portion, which is precisely the most important for the absorption of nutrients