Difusão rotacional em membrana e anisotropia de fluorescência

• Main Author: Alves, Jozismar Rodrigues
• Other Authors: Henriques, Vera Bohomoletz
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2012
• Subjects: anisotropia; anisotropy; difusão rotacional; fluorescence; fluorescência; rotacional diffusion
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/43/43134/tde-27032013-121603/

Propriedades estruturais de membranas modelo, tais como as vesículas lipídicas, podem ser investigadas através da adição de sondas fluorescentes. Após sua incorporação aos sistemas biomoleculares, as moléculas fluorescentes são excitadas por luz linearmente polarizada e a emissão de fluorescência é despolarizada, devido à difusão translacional e também à difusão rotacional do fluoróforo, durante o tempo de vida do estado excitado. O monitoramento da luz emitida é feito através da técnica de fluorescência resolvida no tempo, em que são acompanhadas, por um lado, a intensidade da luz emitida, que fornece o tempo de decaimento da fluorescência, dependente do meio, e, por outro, o decaimento da anisotropia nas componentes da luz emitida, cujos tempos de correlação rotacional informam sobre a fluidez do meio. Uma molécula muito usada como sonda fluorescente é o DPH. Este fluoróforo, bastante hidrofóbico, possui simetria molecular uniaxial, e seus momentos de transição de absorção e emissão são colineares. Um dos usos desta sonda é no acompanhamentos da fluidez da bicamada lipídica ao longo da transição de fase das cadeias. A interpretação de dados experimentais requer modelos para a localização das moléculas fluorescentes, bem como para as possíveis restrições a seu movimento. Neste estudo, apresentamos três modelos para a difusão de moléculas fluorescentes uniaxiais, como o DPH, sugeridos em diversos artigos da literatura. O primeiro modelo consiste de um dipolo com rotação livre aleatória em solução homogênea, e serve como base para os modelos de difusão em meios anisotrópicos. No segundo modelo, consideramos rotações aleatórias dos dipolos reemissores no interior de cones distribuídos com seus eixos perpendiculares à vesícula esférica, geometria que pode refletir o movimento da sonda com eixo em media paralelo às cadeias lipídicas, restrito por elas. No terceiro modelo, o dipolo rotacional no plano da bicamada de geometria esférica, movimento que poderia ocorrer entre as monocamadas que constituem a bicamada. Para cada um dos modelos propostos analisamos a difusão rotacional da sonda através de dois métodos: (i) resolvemos a equação de difusão, para uma única molécula, levando em conta as condições de contorno impostas pelos modelos e determinamos a probabilidade da molécula ser encontrada com uma dada configuração em um tempo t. considerando a distribuição de moléculas na geometria proposta, obtemos a expressão analítica para a anisotropia de fluorescência. No caso da geometria do cone, a solução é obtida numericamente; (ii) realizamos simulações numéricas do passeio aleatório rotacional restrito, nas geometrias correspondentes, método muito útil no caso de geometrias de baixa simetria ou de composição de geometrias. Realizamos um estudo exploratório dos dados experimentais para DPH em membrana modelo, à luz dos resultados para os dois modelos propostos para este meio anisotrópico. === Structural properties of model membranes, such as lipid vesicles, may be investigated through the addition of fluorescent probes. After incorporation into the biomolecular system, the fluorescent molecules are excited with linearly polarized light and the fluorescence emission is depolarized due to translational as well as rotational diffusion during the life-time of the excited state. The monitoring of emitted light emitted informs on fluorescence decay times, and the decay of the components of the emitted light yield rotational correlation times which inform on the fluidity of the medium. The fluorescent molecule DPH, of uniaxial symmetry, is rather hydrophobic and has collinear transition and emission moments. It has been used frequently as a probe for the monitoring of the fluidity of the lipid bilayer along the phase transition of the chains. The interpretation of experimental data requires models for localization of fluorescent molecules as well as for possible restrictions on their movement. In this study, we develop calculations for three models for uniaxial diffusion of fluorescent molecules, such as DPH, suggested in several articles in the literature. The first model consists of a free randomly rotating dipole in a homogeneous solution, and serves as the basis for the study of the diffusion of models in anisotropic media. In the second model, we consider random rotations of emitting dipoles distributed within cones with their axes perpendicular to the vesicle spherical geometry: this could mimic the movement of the probe axis parallel to an average lipid chain. In the third model, the dipole rotates in the plane of the bilayer spherical geometry, within a movement that might occur between the monolayers forming the bilayer. For each of the models proposed, two methods are used by us in order to analyse the rotational diffusion: (1) solution of the corresponding rotational diffusion equation for a single molecule, taking into account the boundary conditions imposed by the models, for the probability of the fluorescent molecule to be found with a given configuration at time t. considering the distribution of molecules in the geometry proposed, we obtain the analytical expression for the fluorescence anisotropy, except for the cone geometry, for which the solution is obtained numerically; (11) numerical simulations of a rotational random walk restricted in geometries corresponding method very useful in case of low-symmetry geometries or geometries of composition. In this study, we have reproduced existing calculations, in some cases, extended calculations developed previously by other authors, in others, or, still, developed new calculations. As an application of our methodology for analysis of diffusional rotations, we have conducted an exploratory study of the experimental data for DPH in lipid bilayers, in the light of the results for the two models proposed for anisotropic media.