Efeito de lesões em DNA produzidas por luz Ultravioleta no processo de replicação do genoma de células de mamíferos

• Main Author: Schumacher, Robert
• Other Authors: Meneghini, Rogério
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 1981
• Subjects: Cell division; Danos do DNA; Divisão celular; DNA damage; DNA replication; Genomas; Genomes; Replicação do DNA
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26112013-150223/

Estudou-se o comportamento frente a radiação UV de células humanas XP12RO, deficientes em reparo-excisão de dímeros de pirimidina. Cinéticas de incorporação de precursor radiativo de DNA em tempos crescentes apos a exposição a UV mostraram uma rápida inibição da taxa de síntese, até se alcançar um platô bem abaixo do valor obtido para células não irradiadas. Tanto o tempo para que este platô fosse alcançado quanto o valor basal de síntese obtido dependiam da dose de UV fornecida. Este tempo era compatível com o necessário para que a maquinaria de replicação percorresse a distância média interdímeros esperada para a dose de UV aplicada. Verificou-se também que o DNA recém-sintetizado após UV apresentava um peso molecular e uma taxa de elongação bem menores que nos controles não irradiados, sugerindo todos estes resultados que o dímero se constitue num bloqueio temporário para a replicação de DNA. Utilizando uma metodologia baseada no tratamento do DNA nativo com S1 endonuclease de Aspergillus oryzae, específica para DNA simples-fita, foi possível detectar a existência de lacunas de DNA replicado após UV, lacunas estas que desaparecem gradativamente com o passar do tempo pós-irradiação. DNA não irradiado manteve-se refratário à enzima, nas mesmas condições. A digestão enzimática acarretava o aparecimento de duas populações distintas de DNA, uma de alto peso molecular e outra de peso molecular bem menor, ambas se equivalendo em quantidade. Este fenômeno pôde ser observado em uma ampla faixa de doses de UV, tanto em células XP12RO como em outras linhagens celulares, e mesmo sob condições diversas de proliferação celular. Além disso, o desaparecimento das lacunas, no caso de células de roedor previamente irradiadas com UV, era retardado pela presença de cafeína, um conhecido inibidor de reparo pós-replicação (RPR) nestas linhagens. Foi efetuada uma análise da progressão da forquilha de replicação e da distribuição de lacunas do DNA replicado após UV, através de ensaios enzimáticos combinados com bandeamento de DNA em gradientes isopícnicos de CsCl. Os resultados assim obtidos levaram-nos a considerar um modelo de replicação a partir de molde lesado onde síntese descontínua (3\'-5\') propicia a formação de lacunas, enquanto que síntese contínua (5\'-3\') é retardada temporariamente pela presença da lesão, sem contudo acarretar a formação de descontinuidades físicas no DNA replicado. A mesma metodologia de digestão de DNA com S1 endonuclease permitiu verificar a ocorrência de uma nítida relação causal entre a frequência de lacunas e a frequência correspondente de dímeros, em crescentes doses de UV, sugerindo fortemente que dímeros estão opostos às lacunas no DNA recém sintetizado. Além disso, um tratamento estatístico da cinética de clivagens enzimáticas observada para as lacunas tornou possível calcular a extensão física destas, detectando-se a presença de duas populações distintas, onde 65% correspondem a 1250 nucleotídeos e 35% correspondem a 150 nucleotídeos. Finalmente, foi verificado que DNA recém-sintetizado longos tempos após UV apresenta um drástico declínio da frequência de lacunas, não obstante a frequência de dímeros permanecer essencialmente inalterada. Estes resultados favorecem a hipótese de ocorrer um processo induzido de RPR, o qual permitiria à maquinaria de replicação transpor eficientemente os dímeros presentes, apesar destes não terem propriedades codificadoras. === The synthesis of DNA in human XP12RO cells, deficient in excision repair of pyrimidine dimers was studied. The rate of incorporation of radioactive precursors into DNA was measured at different times after irradiation. The DNA synthesis decreases shortly after irradiation, reaching a lateau whose value and time to be attained was dependent on the UV dose. This time period was the one expected for the replication machinery to coyer the interdimer distance at the UV dose applied. It was also verified that the newly synthesized DNA after UV irradiation presented much smaller molecular weight and elongation rate, when compared with the non-irradiated controls. These results suggest that the dimer imposes a delay to DNA replication machinery. Using a methodology based on the treatment of native DNA with S1-endonuclease from Aspergillus orizae, specific for single-stranded DNA, it was possible to detect gaps in the DNA replicated after UV treatment. Thesee gaps disapeared gradually with time after irradiation. The nonirradiated DNA remained refractory to the enzyme, under the same experimental conditions. The enzymatic digestion originated approximately equal alounts of two distinct double-stranded DNA populations, one of high molecular weight and other of much smaller molecular weight. This fenomenon could be seen on a wide range of UV doses, in XP12RO cells as well as in other cells lines, and did not depend on the particular conditions of cell proliferation. Furthermore, the gap disappearence, in the case of rodent cells previously irradiated with UV, was delayed by the presence of caffeine, a known post-replication repair (PRR) inhibitor in these cell lines. An analysis of the progression of the replication fork and of the distribution of gaps in the DNA replicated after UV irradiation was carried out through enzymatic assays combined with DNA banding in isopicnic CsCl gradients. The results thus obtained led us to consider a model for replication on damaged template, whereby gaps are formed only in the strand replicating opposite the fork movement (3\'-5\'). The strand replicating in the same direction as the fork movement (5\'-3\') is temporarily delayed by the presence of the lesion, without originating gaps in the replicative DNA. The same methodology of DNA digestion with S1-endonuclease permitted us to verify the occurrence of a nitid relationship between the gap frequency and the corresponding dimer frequency, for different doses of UV, strongly suggesting that the dimers are opposite the gaps in the newly-synthesized DNA. Furthermore, an statistical analysis of the dependende of DNA cleavage by S1-endonuclease on the enzyme concentration rendered it possible to calculate the size of the gaps. Two distinct populations were detected, 65% corresponding to 1250 nucleotides and 35% corresponding to 150 nucleotides. Finally, it was verified that the nascent DNA synthesized long periods after UV are essentially free of gaps although the dimer frequency remained almost unaltered. These results favour the hypothesis of the occurrence of an induced process of PRR, which would permit the replication machinery to efficiently bypass the dimers, in spite of the fact that these lesions do not exhibit codifying properties.