Identificação de alvos moleculares associados à resistência a gemcitabina e análogos de rebecamicina usando Saccharomyces cerevisiae como modelo celular

• Main Author: Cavalcante, Lucas de Sousa
• Other Authors: Souza, Gisele Monteiro de
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2013
• Subjects: Análogos de rebecamicina; Cancer; Câncer; Gemcitabina; Gemcitabine; Levedura; Rebeccamycin analogs; Toxicogenômica; Toxicogenomics; Yeast
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-24032014-131349/

O câncer é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. O envelhecimento da população mundial, especialmente nos países em desenvolvimento, indica que esse índice tende a aumentar a cada ano. Como o câncer é uma doença complexa, uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na carcinogênese e na resposta aos tratamentos atuais são essenciais para mudar esse cenário. Gemcitabina e rebecamicina são moléculas que apresentam atividade antitumoral, sendo que a primeira é usada como agente único no tratamento de adenocarcinoma pancreático, ou em conjunto com outras drogas em vários tipos de câncer, enquanto que alguns análogos da segunda já foram utilizados em testes clínicos de fase II em câncer de mama e pulmão. A gemcitabina é um análogo de desoxicitidina que interrompe a síntese de DNA, além de apresentar efeito inibitório sobre várias proteínas, como ribonucleotídeo redutase. A rebecamicina e vários de seus análogos são indolocarbazóis que incluem moléculas intercalantes de DNA, além de inibidores da topoisomerase I e de algumas proteína quinases, como PKC e Chk1. Alguns indolocarbazóis apresentam também importante atividade antimicrobiana. Os mecanismos de resistência a essas drogas são pouco conhecidos e alguns já foram sugeridos; porém, ainda não há consenso sobre as vias celulares envolvidas. A proposta desse trabalho foi identificar genes associados às respostas a gemcitabina e análogos de rebecamicina, usando Saccharomyces cerevisiae como modelo celular. Avaliamos a atividade biológica de nove análogos de rebecamicina sintéticos, destacando o composto mais promissor para estudos mais aprofundados. Por meio de análise direta de fenótipo em escala genômica, identificamos genes cuja deleção resulta em hipersensibilidade ao análogo de rebecamicina, dentre eles um sensor de estresse relacionado à via Pkc1/Mpk1 quinase (SLG1), uma lisina deacetilase (RPD3) e uma lisina demetilase (JHD2). Esses três genes estão relacionados a uma maior atividade de proteínas de resistência multidroga, sugerindo que diversas vias regulatórias são importantes na resposta a indolocarbazóis. Também verificamos, por análise quantitativa de fenótipo (ensaio Bar-Seq), que a deleção de genes com funções atualmente pouco relacionadas à gemcitabina conferiam maior sensibilidade a droga, como uma arginina metiltransferase (HMT1) e uma subunidade do complexo Cop9 sinalossomo (CSI1), o qual está relacionado a regulação da atividade de diversas proteínas, incluindo ribonucleotídeo redutase. Em conjunto, nossos resultados demonstram que vias ainda não relacionadas a resposta a esses compostos podem ser de grande contribuição para a compreensão dos mecanismos de resistência aos mesmos, auxiliando no desenvolvimento de novos tratamentos e fármacos. === Cancer is one of the main causes of death throughout the world. Population aging, especially in developing countries, points to an increase in cancer incidence over the coming years. As cancer is a complex disease, a better understanding of the mechanisms involved in carcinogenesis and in the current treatments is essential to change this scenario. Gemcitabine and rebeccamycin are molecules that present antitumoral activity. The first one is currently used as a single agent in pancreatic cancer treatment or in combination with other drugs in several types of cancer, while analogs of the second have been tested in phase II clinical trials in breast and lung cancers. Gemcitabine is a deoxycytidine analog that inhibits DNA synthesis, and also presents inhibitory effects over several proteins, such as ribonucleotide reductase. Rebeccamycin and its analogs are indolocarbazoles which include DNA intercalant molecules, as well as topoisomerase I and protein kinase inhibitors, such as PKC and Chk1. The mechanisms related to the resistance to these drugs are poorly understood and some of them have been suggested; even though, there is no consensus about the cellular pathways involved. The aim of this work was to identify genes associated to the response to gemcitabine and rebeccamycin analogs using Saccharomyces cerevisiae as a model cell. We evaluated the biological activity of nine synthetic rebeccamycin analogs, selecting the most promising compound for deeper studies. In a genome-wide qualitative phenotypic analysis, we have identified genes whose disruption resulted in hypersensitivity to the rebeccamycin analog. Among them, we found a stress-sensor involved in Pkc1/Mpk1 kinase pathway (SLG1), a lysine deacetylase (RPD3) and a lysine demethylase (JHD2). These three genes are related to an increased multidrug resistance activity, suggesting that several regulatory pathways play a role in the response to indolocarbazoles. We also found, by means of a quantitative phenotypic analysis (Bar-Seq assay), increased sensitivity to gemcitabine in null-mutants of genes whose functions are currently poorly related to the drug, like an arginine methyltransferase (HMT1) and a subunit of Cop9 signalosome complex (CSI1), which is related to activity regulation of several enzymes, including ribonucleotide reductase. Together, our results show that pathways which were previously unrelated to the response to these compounds can be useful for a better understanding of their resistance mechanisms, providing insights into new drug development and therapy.