Análise comparativa de métodos moleculares de detecção e identificação de Leishmania spp. e desenvolvimento de metodologia para o diagnóstico de leishmanioses.

• Main Author: Zampieri, Ricardo Andrade
• Other Authors: Shaw, Jeffrey Jon
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2014
• Subjects: Leishmania identification; Alvos de DNA; Detecção de polimorfismos; DNA targets; HRM; Identificação de Leishmania; PCR; Polymorphisms detection
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42135/tde-22092014-182045/

No Brasil, leishmanioses são causadas por 7 espécies de Leishmania. Assim, um diagnóstico diferencial se torna relevante. Este trabalho tem como objetivos avaliar condições de armazenamento de amostras, métodos de extração de DNA e desenvolver protocolos de diagnóstico de leishmanioses. O tratamento de amostras com tampão NET produziu os melhores resultados e os métodos de extração não influenciaram a qualidade dos testes. Com os alvos testados por PCR, os melhores resultados foram alcançados com a utilização do 18S e o emprego da técnica de nested PCR com esse alvo aumentou a sensibilidade de detecção. A utilização de PCR multiplex com alvos 18S e g6pd foi capaz de detectar parasitas e discriminar seu subgênero. A aplicação da técnica HRM sobre mutações do 18S foi precisa na discriminação de L. chagasi e mutações no gene g6pd permitiram a discriminação de L. amazonenses, L. braziliensis e subgênero L. (Viannia). Este trabalho propõe protocolos de conservação de amostras, extração de DNA e ensaios de identificação de Leishmania, testados em amostras padronizadas. === In Brazil, leishmaniasis is caused by 7 Leishmania species. Thus, a differential diagnosis becomes relevant. This work aims are to evaluate samples storage conditions, methods of DNA extraction and develop diagnostic protocols for leishmaniasis. Treatment of samples with NET buffer produced the best results and extraction methods did not affect the quality of PCR tests. Regarding PCR targets tested, the best results were achieved using 18S gene and the use of nested PCR increased detection sensitivity. The use of multiplex PCR targeting 18S and g6pd genes enabled Leishmania detection and subgenus discrimination. The implementation of HRM technique on 18S mutations was accurate to discriminate L. chagasi and mutations in the g6pd allowed discrimination of L. amazonenses, L. braziliensis and L. (Viannia) subgenus. This work proposes sample conservation and DNA extraction protocols for Leishmania detection, tested on standard sampling protocols, and identification using HRM technique.