Isolamento em ovos embrionados e cultura celular do vírus da Laringotraqueíte Infecciosa e a padronização de um PCR em Tempo Real para a detecção do gene ICP4 deste vírus

• Main Author: Parra, Silvana Hipatia Santander
• Other Authors: Ferreira, Antônio José Piantino
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2016
• Subjects: Caracterização; Characterization; Detecção molecular; ILT; Isolamento; Isolation; LTI; Molecular Detection; PCR
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10133/tde-20032017-142954/

A Laringotraqueíte Infecciosa (LTI) é uma doença respiratória altamente contagiosa, que acomete principalmente galinhas, é causada por um Gallid herpesvirus tipo 1. As aves infectam-se através do trato respiratório e por via ocular, sendo as aves com infecção clínica as principais transmissoras do vírus. Outras fontes de transmissão são as aves com infecções latentes, materiais de cama e fômites contaminados. Os sinais clínicos geralmente aparecem entre 6 a 12 dias da exposição natural e em infecções experimentais entre 4 a 7 dias pós infecção (p.i). Na forma subclínica pode-se observar uma leve traqueíte mucoide, sinusite, conjuntivite, com morbidade variável e baixa mortalidade. Na forma severa, as aves apresentam depressão, dispneia, espirros, corrimento nasal, conjuntivite, expectoração de secreção sanguinolenta. A taxa de morbidade é alta, comprometendo 100% do lote e a mortalidade pode ocorrer em até 70% do plantel, embora taxas de 10 a 20% sejam as mais frequentes. O agente causador desta doença pode ser propagado na membrana corio-alantóide (MCA) de embriões de frango em desenvolvimento e replicado em células de rim de frangos adultos, como também, em uma variedade de células epiteliais de embrião como do rim, do fígado e do pulmão. Existem vários procedimentos para o diagnóstico da LTI como: a observação de sinais clínicos, a observação de lesões macroscópicas e lesões histopatológicas e o uso de técnicas moleculares como: RFLP, PCR e PCR em tempo real. Como a PCR em tempo real apresenta uma maior sensibilidade quando comparada com outros métodos de diagnóstico, permite quantificar o número de cópias amplificadas do genoma viral, assim como, a diferenciação da doença na fase aguda ou crônica, reduzindo o número de possíveis falsos positivos, esta foi usada para a detecção deste vírus. O objetivo deste trabalho foi isolar o VLTI em ovos embrionados, descrever as lesões macroscópicas causadas pelo vírus, detectar o vírus pela reação de PCR em tempo real, usando como alvo da reação o gene ICP4, padronizar uma reação de PCR em Tempo Real usando a glicoproteína E como alvo da reação e propor o seu uso no diagnóstico de rotina. === The Infectious Laryngotracheitis (ILT) is a highly contagious respiratory disease that affects mainly chickens; caused by a Gallid herpesvirus type 1. Infect birds, by the respiratory tract and by the ocular route, the birds with clinical infection the main transmission of the virus. Other transmission sources are birds with latent infections, bedding materials and contaminated fomites. Clinical signs generally appear between 6 to 12 days exposure of the natural and in experimental infections between 4 and 7 days post infection (p.i). In subclinical form can observe a slight mucoid tracheitis, sinusitis, conjunctivitis, variable morbidity and low mortality. In the severe form, the birds present depression, dyspnea, sneezing, nasal discharge, conjunctivitis, expectoration of bloody discharge. The morbidity rate is high, impairing the lot 100% and mortality may occur in up to 70% of the flock, although 10 to 20% rates are the most frequent. The causative agent of this disease can be propagated in chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos develop and replicated in adult chicken kidney cells as well as in a variety of epithelial-cell embryo as kidney, liver and lung. There are several procedures for the diagnosis of LTI as observation of clinical signs, observation of gross lesions and histopathological lesions, and the use of molecular techniques as RFLP, PCR and real time PCR. As the real-time PCR has greater sensitivity compared to other diagnostic methods to quantify the number of amplified copies of the viral genome, as well as the differentiation of the disease in the acute or chronic phase, reducing the number of potential false positives, this was used for detection of virus. The objective of this study was to isolate the VLTI in embryonated eggs, describe macroscopic lesions caused by the virus, detect the virus by PCR reaction in real time, using as a target of reaction the ICP4 gene, standardize a PCR reaction in real time using the glycoprotein E as a target of reaction and propose their use in routine diagnosis.