Identificação e análise funcional de interações proteína-proteína do sistema de secreção do tipo III do Xanthomonas axonopodis pv. citri<I/>

• Main Author: Cappelletti, Paola Alejandra
• Other Authors: Farah, Shaker Chuck
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2010
• Subjects: Citricultura; Citrus industty; Effector Proteins; Pathogenicity; Patogenicidade; Pilus; Proteínas efetoras; T3SS; Xanthomonas
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08112010-101336/

O cancro cítrico é considerado na atualidade uma das doenças mais perigosas e prejudiciais à citricultura brasileira e mundial, devido aos danos causados na produção e qualidade dos frutos, sendo a Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) a bactéria fitopatogênica responsável por tais prejuízos. Nosso laboratório iniciou estudos de identificação e análise funcional das interações proteína-proteína de Xac envolvendo sistemas importantes para sua patogenicidade (Alegria et. al., 2004). Nosso objetivo principal foi o estudo funcional e fisiológico de interações já identificadas entre proteínas do sistema de secreção do tipo III (T3SS) da Xac. O foco de nossa pesquisa foi tentar desvendar a importância biológica, na patogenicidade de Xac, das interações proteína-proteína: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaB-HrcV; HrpD6-HrpB1- HrpW. Com este intuito clonamos, expressamos e purificamos as proteínas recombinantes. Produzimos soros policlonais específicos contra cada uma das proteínas citadas acima. Estudamos a interação entre as proteínas in vitro por meio de técnicas como Far-Western Blot, Pull Down, fluorescência e dicroísmo circular. Outro enfoque do nosso trabalho foi monitorar a contribuição individual destas proteínas no desenvolvimento da doença in planta. Para isso produzimos cepas de Xac mutantes para os genes hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 e hrpG. Os nocautes não polares foram infiltrados em plantas de laranja pêra, assim como também as cepas de complementação correspondentes, e assim foi testada a habilidade de desenvolver o cancro cítrico e/ou reverter os sintomas da doença. Também foi monitorada a capacidade de multiplicação e sobrevida in planta das cepas Xac &#916;hrpB2, &#916;hrcU e &#916;hpaB, assim como a secreção das proteínas HrpB2 e HpaA pelo T3SS de Xac. Estudamos com mais detalhe a possível função de HrpB2 no T3SS de Xac, desenvolvendo experimentos para determinar a região da proteína imprescindível para sua função permanecer inalterada. Realizamos mutações sítio dirigidas, a fim de introduzir códons de terminação em diferentes regiões da proteína e testar a habilidade desses fragmentos de reverter os sintomas da doença na planta. Monitoramos a capacidade de proteínas mutantes de reverter fenótipos de patogenicidade em citrus, ausentes na cepa Xac &#916;hrpB2 e revertidos na cepa de complementação Xac &#916;hrpB2+pUFR047_hrpB2. Desta maneira, determinamos que os últimos seis aminoácidos de HrpB2 estão envolvidos no desenvolvimento da/s função/ões em Xac. === Citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is a disease with significant economic consequences for the Brazilian and global citrus industry due to reductions in production and fruit quality. Our laboratory has initiated studies for the identification and functional analysis of protein-protein interactions involving Xac systems involved in pathogenicity (Alegria et. al., 2004). One objective has been to study functional and physiological interactions between proteins that make up the Xac Type III secretion system (T3SS). The focus of the present study is to unravel the biological significance in Xac pathogenicity of the following previously identified protein-protein interactions: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaBHrcV; HrpD6-HrpB1-HrpW. With therefore cloned, expressed and purified the above-mentioned recombinant proteins. Specific polyclonal serum were produced and interactions between the proteins were studied in vitro using a variety of methods, including Far-Western Blot, Pull Down, fluorescence and circular dichroism. To monitor the individual contribution of these proteins in disease development in planta, we produced mutant Xac strains in which the hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 and hrpG genes were disrupted. The nonpolar knockouts as well as the corresponding complementation strains were infiltrated into Citrus sensensis plants and the development of citrus canker symtoms and bacterial proliferation in planta was evaluated. We also evaluated the T3SS-dependent secretion of proteins HpaA and HrpB2 by these Xac mutant strains. Structure-function relationships of the HrpB2 protein were studied in more detail. We developed experiments to determine the region of the protein essential for its function. We produced a series of hrpB2 mutants which were used to complement the hrpB2 knockout strain and evaluated their abilities to reverse the symptoms of the disease in the plant. The results demonstrate that the last six amino acids HrpB2 are important for its function in the development of disease symptoms by Xac.