Utilização de células CHO cultivadas na presença de cicloheximida para obtenção e caracterização de prolactina humana glicosilada (G-hPRL) recombinante

• Main Author: Heller, Susana da Rocha
• Other Authors: Soares, Carlos Roberto Jorge
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2008
• Subjects: CHO; Ciclohexímida; Cicloheximida; Prolactina Glicosilada; Prolactina glicosilada
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-07072009-160412/

A Prolactina humana hPRL é um hormônio protéico com 199 aminoácidos (MM ~ 23.000 Da) com um amplo espectro de atividades biológicas, sendo mais conhecido por estimular a lactação e regular o crescimento e diferenciação da glândula mamária. Além de quebra proteolítica, a maioria dos variantes de prolactina podem ser resultantes de outros processos pós-traducionais como polimerização, fosforilação, desamidação, sulfatação e glicosilação. Essa proteína contém apenas um sítio potencial de glicosilação por ligação à asparagina, localizada no aminoácido 31, que é parcialmente ocupado (10%) quando a proteína é sintetizada em células eucariotas. Apesar da atividade biológica in vitro da prolactina glicosilada (G-hPRL) ser muito menor (~4 vezes) quando comparada à não glicosilada, sua função fisiológica ainda não é bem definida e a porção de carboidrato parece ter um importante papel na biossíntese, secreção, atividade biológica, e clearance plasmático do hormônio. Com o objetivo de melhor caracterizar e estudar esta variante hormonal, foi realizada sua purificação em escala laboratorial a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO) modificadas geneticamente, utilizando meio de cultura suplementado com cicloheximida, aumentando ~4 vezes sua concentração absoluta e ~10 vezes a razão entre a isoforma glicosilada e a não-glicosilada. A purificação da G-hPRL seguiu um processo simples e efetivo de duas etapas principais baseado em uma coluna de troca catiônica e uma coluna preparativa de exclusão molecular acoplada a um sistema de cromatografia líquida de excusão molecular de alta eficiência (HPSEC). A caracterização foi feita por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) e exclusão molecular, SDS-PAGE, Western Blotting, espectometria de massa (MALDI-TOF) e um bioensaio in vitro utilizando células Nb2 e Ba/F3-LLP. Nossos resultados demostram que a cicloheximida pode ser uma importante ferramenta para aumentar a produção de prolactina glicosilada, facilitando a purificação e caracterização dessa isoforma. === Human prolactin hPRL is a 199 aminoacid protein hormone (MM ~23.000 Da) with a wide spectrum of biological activities being, however, best known for its stimulation of lactation and development of mammary gland. Besides proteolytic cleavage, the majority of prolactin variants can be the result of other posttranslational processing of the mature molecule in the anterior pituitary gland or the plasma. These include polymerization, phosphorylation, deamidation, sulfation, and glycosylation. This protein contains only one potential asparagine-linked glycosylation site which is partially ( ~10%) occupied when the protein is synthesized in eukaryotic cells. Although the biological activity of glycosylated hPRL (G-hPRL) has been found ~ 4-fold lower compared to that of hPRL, its physiological function is not well defined yet, and the carbohydrate moiety seems to play an important role in the biosynthesis, secretion, biological activity, and plasma clearance of the hormone. In order to better characterize and study this hormone variant, we carried out its laboratory scale synthesis and purification from genetically modified CHO cells medium that had been supplemented with cycloheximide, increasing thus ~4-fold its absolute concentration and ~10-fold the glycosylated versus non-glycosylated hPRL concentration ratio. G-hPRL purification was carried via a simple and effective two-step process based on a cationic exchanger and a preparative size-exclusion HPLC column (HPSEC). Characterization was carried out by reversed-phase and size-exclusion HPLC, SDS-PAGE, western blotting, MALDI-TOF MS and in vitro bioassay utilizing Nb2 and Ba/F3-LLP cells. Ours results show that cycloheximide can be an important tool to increase the production of glycosylated proteins hPRL facilitating the purification and characterization of these isoforms.