Interação da crisotila com células de carcinoma de pulmão humano em cultura: interferência com a mitose utilizando genes repórteres e microscopia em tempo real e estudo do potencial genotóxico

• Main Author: Cortez, Beatriz de Araujo
• Other Authors: Santelli, Glaucia Maria Machado
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2010
• Subjects: Aneuploidia; Aneuploidy; Chrysotile; Crisotila; Mitose; Mitosis
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-05042010-134617/

Asbesto é um nome geral dado a seis tipos de fibras minerais encontradas naturalmente na crosta terrestre. Estas fibras vêm sendo exploradas industrialmente desde 1970, porém diversos trabalhadores expostos às fibras apresentaram patologias no trato respiratório, como fibroses e carcinomas. Alguns tipos de fibra foram banidos do mercado, porém o tipo de asbesto crisotila ainda pode ser comercializado na maioria dos países. Estudos in vivo e in vitro tentam elucidar as alterações causadas pela exposição à asbesto nos tecidos e nas células que possam estar relacionadas ao aparecimento de doenças, e foi verificado que a exposição às fibras leva a quebras na dupla fita de DNA, estresse oxidativo, formação de células micronucleadas e células aneuploides. O presente estudo teve como objetivo verificar a presença de alterações causadas em células em cultura expostas à crisotila por 48 h e recuperadas em meio livre de fibras por 48 h, 4 dias e 8 dias, além de observar por microscopia em tempo real divisões aberrantes após a exposição as fibras por 24 e 48h. Foram verificadas alterações que permaneceram na cultura mesmo após 8 dias de recuperação, quando não foram mais observadas fibras na cultura, como formação de células aneuploides, diminuição de frequência de células em G0/G1, aumento de células em G2/M e aumento relativo de células em metáfase quanto à porcentagem de células em fases mais tardias da fase M do ciclo. Já aumento da frequência de células micronucleadas ocorreu apenas nos períodos quando foram observadas fibras na cultura. Para análise da formação de mitoses multipolares e destinos destas células foram construídos vetores para expressão de tubulinas fusionadas a proteínas fluorescentes RFP e GFP, padronizadas as condições de transfecção e de aquisição de imagens para que as células tratadas com crisotila fossem observadas por time-lapse. Alguns destinos de mitoses multipolares causadas pelo tratamento com crisotila foram observados, como morte em metáfase, divisão gerando duas ou três células filhas, fusão de células durante a telófase e retenção em metáfase. Os dados sugerem também a indução da amplificação centrossômica, que parece ocorrer inicialmente em células interfásicas, e também devido à fusão de células. === Asbestos is a general name given to six different fibrous silicate minerals found naturally in the earth\'s crust. These fibers are being exploited industrially since 1970, but several workers exposed to the fibers developed diseases in the respiratory tract, such as fibrosis and carcinomas. Some types of fiber were banished from the market, but the type of asbestos chrysotile can still be marketed in most countries. Studies in vivo and in vitro are trying to elucidate the asbestos effects in tissues and cells that could be related to the development of diseases, and these studies verified that asbestos exposure lead to DNA double strand breaks, oxidative stress, multinucleated and aneuploid cell formation. The present work aimed to verify the alterations in culture cells exposed to chrysotile for 48 h and recovered in fiber-free medium for 48 h, 4 days and 8 days, and also observe aberrant mitosis using time-lapse microscopy after 24 h and 48 h of chrysotile exposure. Some alterations were observed and remained in cell culture even after 8 days of recovery when chrysotile fibers were no longer observed - such as aneuploid cell formation, increased frequencies of G2/M cell, decreased frequencies of G1 cells, and increased frequencies of cells in early M phases as metaphase. The induction of micronuclei occurred only during the periods that fibers were observed in cell culture. For the analysis of multipolar mitosis formation and destinies of these cells after chrysotile treatment, DNA vectors for the expression of tubulins fused to fluorescent proteins (GFP and RFP) were constructed, and the conditions for cells transfection and image acquisition for time-lapse microscopy were established. The fate of some multipolar metaphases was observed: cell retention on metaphase, cell cycle progression generating two or three daughter cells, cell fusion during cytokinesis or during telophase after a multipolar anaphase, and cell death. The centrosome amplification was not observed during the M phase of cell cycle, and may occur in interphase, and also despite cell fusion.