Clonagem e caracterização da enzima epóxido hidrolase de Trichoderma reesei.

• Main Author: Oliveira, Gabriel Stephani de
• Other Authors: Alcalde, Felipe Santiago Chambergo
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2018
• Subjects: Enantioselectivity; Enantiosseletividade; Epoxide hydrolase; Époxido hidrolase; Fungo; Fungus; Inhibitor; Inibidor; Trichoderma reesei
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-03122018-142014/

Epóxido hidrolases (EHs) são enzimas que catalisam a hidrólise de epóxidos a seus correspondentes dióis, apresentam potencial aplicação biotecnológica (separação de enantiômeros na produção de fármacos), estão envolvidas no metabolismo de ácidos graxos poliinsaturados e inibidores de EHs estão sendo estudados para possível utilização no tratamento de doenças. Uma enzima epóxido hidrolase (TrEH) do fungo filamentoso Trichoderma reesei QM9414 foi clonada, expressa, purificada e caracterizada funcionalmente e estruturalmente. A atividade de TrEH foi determinada com o substrato óxido de estireno (racêmico), demonstrando maior atividade nas temperaturas de 23 a 50 °C, no pH 7,2 a 37 °C, e as constantes cataliticas Km= 4,6 mM e kcat= 336 s-1. A enzima recombinante mostrou ser enantiosseletiva, pois hidrolisa preferencialmente (S)-(-)-óxido de estireno, (R)-(-)- epicloridrina e (S)-(-)-1,2-epoxibutano. Moléculas inibidoras da atividade de TrEH foram identificadas e algumas delas inibem até 60% o crescimento de T. reesei. A estrutura terciária de TrEH (1,7 Å) foi determinada por cristalografia, apresenta dobramento α/β-hidrolase e não tem alta homologia com nenhuma outra estrutura de EH. TrEH é uma nova enzima epóxido hidrolase solúvel cujas propriedades mostram seu potencial de utilização em aplicações biotecnológicas. === Epoxide hydrolases (EHs) are enzymes that catalyze the hydrolysis of epoxides to their corresponding diols, present a potential biotechnological application (separation of enantiomers for the production of drugs), they are involved in the metabolism of polyunsaturated fatty acids and EH inhibitors are being studied for possible use in the treatment of diseases. An epoxide hydrolase enzyme(TrEH) from the filamentous fungus Trichoderma reesei QM9414 was cloned, expressed, purified and functionally and structurally characterized. The activity of TrEH was determined with the substrate styrene oxide (racemic), showing higher activity at temperatures of 23 to 50 °C, at pH 7.2 at 37 °C, and the catalytic constants Km= 4.6 mM and kcat= 336 s-1. The recombinant enzyme has been shown to be enantioselective, because it preferably hydrolyzes (S)-(-)-styrene oxide, (R)-(-)-epichlorohydrin and (S)-(-)-1,2- epoxybutane. TrEH inhibitors have been identified and some of them inhibit up to 60% growth of T. reesei . The tertiary structure of TrEH (1.7 Å) was determined by crystallography, showing α/ β-hydrolase folding and low homology with any other EH structure. TrEH is a new soluble epoxide hydrolase enzyme whose properties show its potential for use in biotechnological applications.