Aspectos fenotípicos e moleculares da adesão e atividade enzimática de Candida sp isoladas de pacientes com sinais clínicos de candidíase oral

• Main Author: Costa, Karen Regina Carim da
• Other Authors: Baruffi, Marcelo Dias
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2009
• Subjects: adesão; adhesion; Candida; genes de virulência; genetic variability; protease; variabilidade genética.; virulence genes
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-03122010-093837/

O amplo espectro da candidíase e respectiva importância clínica da infecção impulsionam as pesquisas que visam esclarecer os mecanismos de patogenicidade e identificação dos fatores de virulência de Candida sp. Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar através de testes fenotípicos e moleculares a capacidade de adesão, atividade de proteases e variabilidade genética de isolados clínicos de C. albicans e C. tropicalis. A capacidade de adesão às glicoproteínas de matriz extracelular laminina e fibronectina foi avaliada utilizando-se a técnica de ELISA (Enzyme-linked imunosorbent assay). A pesquisa de proteases foi realizada pelos métodos semiquantitativo, em placa de ágar com albumina bovina, e quantitativo, em solução-tampão com hemoglobina. A presença dos genes ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 e PLB1 foi verificada pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e os polimorfismos intra e interespécies pela técnica do DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD). Todos os isolados de C. albicans e C. tropicalis apresentaram ligação a laminina e a fibronectina imobilizadas. Os isolados Ca33 e Ct13 apresentaram índice de adesão relativa significativamente maiores em relação aos demais isolados para as duas glicoproteínas (p < 0,001). A atividade de proteases foi observada em todos os isolados de C. albicans tanto pelo método semiquantitativo quanto pelo método quantitativo. A atividade de proteases dos isolados de C. tropicalis foi melhor evidenciada através do método quantitativo. A amplificação de fragmentos dos genes relacionados à adesão (ALS2 e ALS3), atividade de proteases (SAP1 e SAP3) e fosfolipase (PLB1) foi observada em todos os isolados de C. albicans. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produtos de amplificação para os genes pesquisados. A variabilidade genética avaliada pela técnica do RAPD revelou uma população heterogênea em ambas as espécies. No entanto, C. tropicalis apresentou maior diversidade genética que C. albicans. === The wide spectrum of candidiasis and its clinical importance encourage the research with the purpose of clarifying the mecanisms of pathogenicity and identification of virulence factors of Candida sp. Therefore, the aim of this study was to verify through phenotypic and molecular assays the adhesion, enzymatic activity e genetic variability of clinical C. albicans and C. tropicalis isolates. The adhesion ability to the extracellular matrix glycoproteins laminin and fibronectin was evaluated using the ELISA technique (Enzyme-linked imunosorbent assay). The research of proteases was carried out in agar plate containing bovine albumin and through a quantitative method in buffer solution containing hemoglobin. The presence of ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 and PLB1 was verified using polimerase chain reaction (PCR) and intra and interespecies polimorphisms through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) technique. All C. albicans and C. tropicalis isolates binded to immobilized laminin and fibronectin. Ca33 and Ct13 isolates had relative adhesion index significantly higher than the other isolates for both glycoproteins (p < 0,001). Protease activity was observed in all isolates of C. albicans using either the semi-quantitative or quantitative assay. The protease activity of C. tropicalis was better detected through the quantitative assay. The amplification of genes related to adhesion (ALS2 and ALS3), proteases (SAP1 and SAP3) and phospholipase (PLB1) activity using PCR was observed in all C. albicans strains. PCR amplification products were not observed in C. tropicalis isolates for the researched genes. The genetic variability by RAPD revealed an heterogeneous population in both species. Nevertheless, C. tropicalis presented higher genetic variability than C. albicans strains.