Caracterização do potencial patogênico de linhagens de Yersinia enterocolitica-like

• Main Author: Imori, Priscilla Fernanda Martins
• Other Authors: Falcão, Juliana Pfrimer
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2016
• Subjects: adesão e invasão celular; cell adhesion and invasion assays; electron microscopy and RNA-seq; genes de virulência; microscopia eletrônica e RNA-seq; new virulence mechanisms; novos marcadores de virulência; pathogenic potential; potencial patogênico; sobrevivência no interior de macrófagos humanos; surviving within human macrophages; virulence-related genes; Yersinia enterocolitica-like
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-02052016-104428/

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. === Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.