| Summary: | La poly(A) polymérase (PAP) est une enzyme essentielle pour le métabolisme de la cellule qui catalyse l'ajout d'une longue séquence de polyadénosines à l'extrémité 3' des ARNm. Cet ajout, effectué par un large complexe multi-protéique de clivage et de polyadénylation est nécessaire pour la stabilité, le transport et la traduction des ARNm. L'ATP est la molécule qui sert de source d'énergie à la PAP et représente aussi son unique substrat pour la réaction de polyadénylation. La PAP est une enzyme hautement conservée de la levure à l'humain et est même encodée dans le génome de certains virus. En effet, elle est aussi retrouvée chez les eucaryotes inférieurs, comme les levures, et même certains virus à ADN encodent une enzyme jouant le même rôle. Le champignon Candida albicans , source d'infections sévères surtout chez les patients immunodéprimés, encode sa propre PAP. L'étude de cet organisme tantôt levure unicellulaire, tantôt champignon mycellaire demeure essentielle en raison de la perte d'efficacité des antibiotiques actuellement disponibles découlant de l'émergence de souches multi-résistantes. La PAP représente une nouvelle cible thérapeutique fort intéressante due à son implication directe dans les étapes de maturation des ARNm, processus essentiel à tout organisme eucaryote. L'étude présentée dans ce mémoire se concentre sur l'étude du site actif de la PAP de C. albicans , plus précisément au niveau des interactions moléculaires associées à la sélection du substrat par l'enzyme. Le but final est de déterminer les groupements fonctionnels favorisant la reconnaissance de l'ATP au niveau du substrat nucléotidique, mais aussi de déterminer les acides aminés de la protéine qui sont potentiellement impliqués dans cette sélection moléculaire. Pour ce faire, une gamme d'analogues de nucléotides, principalement de purines, a été testée pour évaluer la capacité de ceux-ci à compétitionner avec le substrat pour le site actif de l'enzyme. Du côté de la protéine, plusieurs mutants ponctuels ont été produits afin d'évaluer la discrimination de ces mutants envers les différents nucléotides et/ou analogues de nucléotides. La sélection des acides aminés mutés s'est basée sur le modèle bioinformatique de la PAP de C. albicans généré à partir de la radiocristallographie de la PAP d'un autre organisme eucaryote effectué en présence d'ATP et d'ARN, Saccharomyces cerevisiae . Les résultats ont en effet démontré que la présence d'un groupement donneur de pont hydrogène en position 6 d'une purine permet sa liaison au site actif de l'enzyme et son transfert subséquent sur le brin d'ARN. En effet, ceci explique en grande partie la discrimination entre l'ATP et le GTP par la protéine. Aussi, l'apport de certains acides aminés tels Asn-222, Met-306 et Cys-307 dans ce mécanisme de distinction des nucléotides a été démontré. De manière insoupçonnée, certains analogues se sont avérés de bons substrats pour la PAP malgré leur modification chimique, donnant lieu à une queue poly(A) modifiée chimiquement. L'impact de cette modification sur la stabilité et l'efficacité de traduction d'ARNm portant divers types de modification sur la queue poly(A) a donc été évalué en cellules. Il s'avère que la stabilité semble négativement affectée de manière générale alors que l'efficacité de traduction s'est vu être dépendante du type de modification chimique.
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