Études de reconstitution des récepteurs lymphocytaires de la phytohemagglutinine dans des vésicules artificielles et insertion chez des cellules somatiques

• Main Author: Letellier, Marc
• Other Authors: Dupuis, Gilles
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 1986
• Online Access: http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/5326

La lectine phytohemagglutinine (PHAf de Phaseolus vulgaris est un agent stimulateur des lymphocytes in vitro. Cette action résulte d'une reconnaissance spécifique de structures oligosaccharidiques de glycoprotéines lymphocytaires, membranaires. Nous avons purifié, par chromatographic d'affinité, une population de glycoprotéines lymphocytaires membranaires liant la PHA. Ces glycoprotéines .réceptrices compétitionnent avec les récepteurs cellulaires de la PHA. Dans le but d’identifier le(s) récepteur(s) essentiel(s) à l'activation des lymphocytes par la PHA, nous avons incorporé par la technique de fusion liposomes-cellules les glycoprotéines liant la lectine chez des cellules somatiques ou lymphocytaires déficientes en récepteurs pour la lectine. Les glycoprotéines purifiées liant la PHA ont été insérées dans des liposomes formés de phosphatidylcholine et de phosphatidylserine par la technique de solubilisation avec le détergent bromure de dodecyltrimethylammonium suivie d'une dialyse. Nous avons montre que 68.8 ± 2.8% des glycoprotéines liant la PHA sont incorporées d'une manière non sélective dans les liposomes. Le Quin 2, un chélateur spécifique des ions calcium, a été encapsulé à l’intérieur des liposomes1 et cette façon de procéder a permis de démontrer que les vésicules contenant les glycoprotéines sont imperméables aux ions calcium, suggérant que les liposomes utilisés dans nos études possèdent une membrane continue. Nous avons montré que les liposomes contenant les glycoprotéines liant la PHA sont agglutinables par la lectine et qu'un traitement protéolytique à la trypsine et à la chymotrypsine abolit cette agglutinabilité. Ce résultat suggère que la partie oligosaccharidique des glycoprotéines est orientée, au moins en partie, vers l'espace extravéhiculaire. Cette observation est supportée par le fait que les liposomes contenant les glycoprotéines lient la [125 1]-PHA d'une manière spécifique et saturable. À saturation, les liposomes lient 1.01 ± 0.05ug de PHA par ug de glycoprotéines incorporées dans les vésicules. Lorsque les données d'attachement de la [125 1]-PHA aux liposomes ont été analysées par la méthode de Scatchard, un profil avec une concavité orientée vers le bas (coopérativité positive) est observé. Nous avons montré, par incorporation de [125 I]-glycoprotéines suivie d'un traitement des liposomes à la trypsine et à la chymotrypsme que 80% des glycoprotéines sont orientées vers le milieu externe. De plus, lorsque les mêmes expériences sont realisées avec des glycoprotéines dont la partie oligosaccaharidique est marquée au tritium, le traitement protéolytique libère 70% de la radioactivité. Ces résultats suggèrent que les récepteurs de la PHA sont orientés d'une manière préférentielle dans les liposomes. Nous avons également montré que les liposomes contenant les glycoprotéines liant la PHA inhibent l'activation des lymphocytes par la lectine. Cette inhibition est dépendante de la quantité de liposomes ajoutées et atteint 50% e une concentration de l.Oug/ml. Cependant, les liposomes traités à la trypsine et à la chymotrypsme perdent la propriété d'inhibition à cette même concentration. Les liposomes contenant les glycoprotéines liant la PHA ont été fusionnés avec des cellules CHO déficientes en récepteurs de la lectine, en utilisant le polyéthylène glycol comme agent de fusion. Cette technique introduit les glycoprotéines dans les cellules tel que démontré par étude de fluorescence et par des études de fixation de la [125 I]-PHA aux cellules modifiées. Une expérience de fusion avec des liposomes contenant des glycoprotéines réceptrices marquées à la fluorescéine a montré que 40% des cellules deviennent fluorescentes. De plus, les cellules résistantes fusionnées lient 3 fois plus de PHA que les cellules non fusionnées. Ces observations suggèrent que les cellules fusionnées ont acquis de nouveaux récepteurs de la PHA dont la partie oligosaccharidique- est orientée vers 1'exterieur de la cellule. Nous avons observé que les cellules fusionnées avec les liposomes contenant les glycoprotéines liant la PHA deviennent sensibles à 1'effet cytotoxique de la PHA dans les quelques heures suivant la fusion. La viabilité des cellules fusionnées cultivées en présence de PHA (200ug/ml) est réduite d'environ 50% après 8 heures d'incubation. En revanche, les cellules résistantes fusionnées avec des liposomes formes uniquement de phospholipides restent viables en présence de PHA pour un même temps d'incubation. Ces résultats sont le premier rapport de l'insertion fonctionnelle de récepteurs glycoprotéiques de la PHA chez des cellules somatiques. Nous avons inséré les glycoprotéines liant la PHA chez les lymphocytes B purifiés. Cette insertion a été faite par voie de fusion, à l'aide des protéines fusogéniques du virus de Sendai reconstituées dans des liposomes contenant les récepteurs de la PHA. Les expériences de fusion en présence de liposomes contenant les glycoprotéines liant la PHA marquées à la fluorescéine ont montré que 51.7 + ou - 2.4% des cellules deviennent fluorescentes et par conséquent ont incorporé les glycoprotéines liant la lectine. Les lymphocytes B fusionnés avec les liposomes contenant les glycoprotéines réceptrices acquièrent la capacité de répondre à la lectine. La stimulation par la PHA des lymphocytes B reconstitués est significativement plus élevé (p<0.001) que dans le cas des lymphocytes B fusionnés avec des liposomes contenant uniquement les glycoprotéines de fusion. Les lymphocytes B reconstitués ne répondent pas à la concanavaline A. Ces résultats indiquent que l’incapacité des lymphocytes B à répondre à la PHA est vraisemblablement due à l'absence de récepteurs membranaires appropriés et que l'insertion de récepteurs lymphocytaires de la PHA "reconstruit" la machinerie nécessaire à l'activation.