Études sur la régulation transcriptionnelle de gènes de chitosanases chez les actinomycètes

• Main Author: Dubeau, Marie-Pierre
• Other Authors: Brzezinski, Ryszard
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 2011
• Subjects: Régulateur de transcription; CsnR; Chitosanase; Chitosane; Kitasatospora; Streptomyces; Actinomycètes
• Online Access: http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/5136

Les actinomycètes sont des microorganismes majoritairement retrouvés dans le sol et reconnus comme étant de grands producteurs de métabolites secondaires et enzymes extracellulaires. Parmi ces enzymes extracellulaires, nous retrouvons la chitosanase qui est apte à hydrolyser le chitosane, un bio-polymère formé majoritairement de D-glucosamine. Étant donné les nombreuses applications du chitosane, celui-ci est produit de façon industrielle par désacétylation de la chitine provenant de l'exosquelette de crustacés. La chitosanase est ensuite utilisée pour produire du chitosane de différents poids moléculaires. La majorité des études portant sur les chitosanases concernent leurs propriétés biochimiques et les relations entre leur structure et leur fonction enzymatique. Aucune étude publiée n'a été portée sur leur régulation génique, ce qui apporterait de nouvelles connaissances fondamentales pouvant améliorer entre autres le rendement de production de l'enzyme.Les chitosanases d'actinomycètes les plus étudiées sont celles de Streptomyces sp. N174 (CsnN 174) et de Kitasatospora sp. N106 (CsnN106). La production endogène de ces enzymes en comparaison avec la production en contexte hétérologue chez Streptomyces lividans , a permis d'émettre comme hypothèse que la production de la chitosanase CsnN106 serait régulée au niveau de la transcription. Notre première étude a donc porté sur la régulation génique de cette chitosanase en contexte endogène. Deux interactions régulatrices ont été repérées au niveau de la séquence promotrice de csnN106 .L'interaction impliquée à la séquence palindromique retrouvée en amont de csnN106 a été caractérisée plus en détails.L'emplacement précis de l'interaction et son activité en présence de molécules inductrices ont été déterminés. La caractérisation a été poursuivie par la détermination de l'importance de chaque paire de base du palindrome sur l'activité de liaison protéine-ADN. Par la suite, nous avons dû changer de stratégie d'étude puisque la purification complète des régulateurs de transcription impliqués dans ces interactions s'avérait impossible à partir d'extraits cellulaires de Kitasatospora sp. N106. Nous avons donc réalisé une recherche informatique sur la présence de boîtes palindromiques homologues à celle de csnN10 6 dans les séquences publiées et génomes actinobactériens séquences (Streptomyces coelicolor A3(2) et Streptomyces avermitilis MA-4680). Mis à part la présence de cette boîte palindromique en amont d'autres gènes codant pour des chitosanases, cette séquence a été retrouvée en amont d'un gène codant pour un régulateur de transcription de la famille ROK chez S. coelicolor et S. avermitilis . Nous avons émis l'hypothèse que le régulateur de transcription produit par ces gènes homologues, était responsable de la régulation de la transcription de gènes de chitosanases. Nous avons décidé d'étudier le gène homologue ( csnR ) et son produit protéique chez S. lividans étant donné l'utilisation de ce microorganisme pour la production hétérologue de protéines et son lien de parenté étroit avec S. coelicolor . Notre deuxième étude présente la caractérisation de CsnR par des expérimentations in vitro utilisant la protéine purifiée. De plus, une souche délétée pour le gène csnR a été utilisée pour effectuer d'autres expérimentations in vivo .Les résultats obtenus ont démontré que ce régulateur de transcription est un répresseur agissant au niveau de la boîte palindromique homologue à csnN106 qui est retrouvée chez S. lividans en amont du gène csnA , codant pour une chitosanase, et en amont du gène csnR . Notre troisième étude porte sur le mécanisme de régulation génique de csnN106 en contexte hétérologue chez S. lividans .L'utilisation de la souche délétée pour csnR a permis de démontrer que csnN106 est aussi régulé négativement par CsnR. Cette souche, ayant été transformée avec un vecteur intégratif ayant csnN106 mutée à sa boîte palindromique, a permis d'élaborer un milieu de production de chitosanase sans ajout de molécules inductrices tel que du chitosane ou ses dérivés. Ce nouveau système de production est aussi efficace que le système utilisé soit S. lividans ayant csnN106 sur un vecteur à haut nombre de copies en combinaison avec un milieu de production plus onéreux, contenant du chitosane et de la D-glucosamine.Les trois études présentées forment un premier bloc de nouvelles connaissances sur la régulation génique des chitosanases. Le mécanisme de répression de la transcription par CsnR au niveau de gènes de chitosanases possédant la boîte palindromique au niveau de leur promoteur semble un mécanisme répandu chez les actinomycètes étant donné la présence de cette boîte et de gènes homologues à csnR dans le génome de plusieurs actinomycètes.