Criblage et clonage des gènes de la N-acetyl-D-glucosaminidase et de la D-glucosaminidase provenant d'actinomycètes et caractérisation de ces protéines extracellulaires d'intérêt industriel

• Main Author: Côté, Nathalie
• Other Authors: Brzezinski, Ryszard
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 2005
• Online Access: http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/5060

L'objectif principal de ce projet de recherche a été de cribler et caractériser deux enzymes extracellulaires provenant d'actinomycètes et ayant un intérêt pour l'industrie biotechnologique et de cloner leurs gènes. Ces deux enzymes sont la N-acétyl-D-glucosaminidase (GlcNAcase) et la D-glucosaminidase (GlcNase). La combinaison de ces deux enzymes, couplée à l'utilisation de la chitosanase, permet l'hydrolyse complète du chitosane en N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) et en glucosamine (GlcN). Les applications de ces enzymes sont nombreuses; entre autres elles peuvent servir d'outil de séquençage des oligomères de chitine et de chitosane, d'outil de détermination du degré d'acétylation du chitosane ou encore à la production biologique d'oligomères et de monomères de GlcNAc et de GlcN. Les marchés visés par ces produits sont importants, il suffit de penser à l'utilisation de la GlcN dans le traitement de l'osthéoarthrite ou encore l'utilisation des oligomères dans les recherches fondamentales. La GlcNAcase produite par un actinomycète isolé d'un compost amendé en carapaces de crevettes, a été caractérisée et son gène a été cloné. Ce microorganisme, nommé C11, a été identifié comme étant apparenté à Streptomyces thermocarboxydus. La procédure utilisée pour le clonage du gène a été basée sur les séquences de certaines GlcNAcases connues de la littérature. Une analyse par alignement de séquences d'ADN codant pour des gènes de GlcNAcases appartenant à la famille 20 des glycosides hydrolases a permis de constater qu'elles possèdent une région hautement conservée. Cette région a été amplifiée à partir du génome de Streptomyces coelicolor A3(2) souche M145 et a servi de sonde lors de l'hybridation de la banque partielle construite à partir de l'ADN génomique de la souche C11. L'optimisation de la production de la protéine recombinante a par la suite été mise au point et la caractérisation biochimique de la protéine a été effectuée. Le séquençage du gène a permis de constater que cette protéine est très similaire aux GlcNAcases produites par Streptomyces thermoviolaceus et Streptomyces plicatus. Pour ce qui est de la deuxième enzyme étudiée, la GlcNase, aucun actinomycète isolé dans notre laboratoire ne possédait une activité détectable. Selon la littérature scientifique, l'actinomycète du nom de Amycolatopsis orientalis possède une activité GlcNase; cette souche a donc été utilisée afin d'atteindre les buts du projet. Le clonage du gène a dû être effectué par génétique inverse puisque aucune séquence n'était disponible à ce moment. L'optimisation de la production et de la purification de la protéine a été la première étape de ce processus. L'identification des acides aminés de la partie N-terminale et d'un fragment interne, par le séquençage de la protéine, a permis la synthèse d'amorces PCR qui ont été utilisées lors de l'amplification spécifique d'une portion du gène ciblé. Ce fragment amplifié a servi de sonde lors de la procédure de clonage du gène à partir d'une banque génomique partielle d'ADN de A. orientalis. Le gène a été cloné dans le vecteur navette pFD666 et la protéine a été exprimée dans la souche Streptomyces lividans. La caractérisation biochimique de la protéine a ainsi pu être effectuée. L'activité exo-glucosaminidase sur des oligomères de chitosane de courtes chaînes ainsi que sur le chitosane de haut poids moléculaire a été mesurée. Cette observation a rendu possible la détermination des constantes cinétiques d'une glucosaminidase en utilisant le chitosane comme substrat et en utilisant la méthode de dosage des sucres réducteurs, cette dernière étant plus sensible que la méthode utilisée lors du dosage de l'activité. La séquence du gène de la GlcNase de A. orientalis a permis de démontrer que cette enzyme forme une nouvelle sous-classe dans la famille des glycosides hydrolases 2 (GH2).