Purification, caractérisation et localisation des ATP diphosphohydrolases de mammifères, et clonage de l'ADNc

• Main Author: Sévigny, Jean
• Other Authors: Beaudoin, Adrien
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 1997
• Online Access: http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4958

Une revue de la littérature nous avait indiqué que chez les mammifères l'ATPDase entait une protéine membranaire intrinsèque qui à cause de sa sensibilité aux détergents et de sa faible quantité dans les tissus, était qualifiée d'enzyme difficile à purifier. La première partie de ce travail consistait donc à élaborer un protocole afin de purifier les trois types d'ATPDases mis en évidence dans notre laboratoire. Ce protocole incluait dans l'ordre des étapes de centrifugations différentielles, une centrifugation sur coussin de sucrose, la solubilisation des protéines avec le Triton X-100, un fractionnement par trois chromatographies successives (colonnes DEAE-agarose, Affi-Gel Bleu et Concanavalin A- ou Wheat Germ Agglutininagarose) et séparation par électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions non dénaturantes. Les protéines purifiées du pancréas de porc et de l'aorte de boeuf ont été séquencées. Les 19 acides aminés de la séquence N-terminale de l'ATPDase du pancréas ainsi que cinq séquences internes de 7 à 24 acides aminés de l'isoforme de l'aorte ont été obtenues. L'analyse de chacune des six séquences obtenues, avec les banques de données GenBank et EMBL, a montré une forte similarité entre leurs acides aminés et ceux de CD39 humaine. Aucune fonction ne lui avait été attribuée. D'autres informations venaient confirmer l'homologie entre CD39 et l'ATPDase : la masse moléculaire et le niveau de N-glycosylation de CD39 correspondaient parfaitement avec ceux des ATPDases de l'aorte et du poumon de boeuf. Nous avons aussi montré qu'un anticorps commercial dirigé contre CD39 immuno précipitait les activités ATPasique et ADPasique d'un extrait de cordons ombilicaux humains, un tissu riche en ATPDase. Nous avons alors établi une collaboration pour cloner l'ADNc de CD39. Ce dernier a été cloné dans un vecteur d'expression, puis exprimé par transfection transitoire dans les cellules COS. Cette expérience a démontré hors de tout doute que CD39 est une ATPDase. Nous avons montré in vitro que l'ATPDase/CD39 produite dans les cellules COS pouvait inhiber l'agrégation plaquettaire induite par divers agonistes physiologiques, tels l'ADP, la thrombine et le collagène. En plus de l'ADNc, nous avons développé d'autres outils qui facilitent l'étude des rôles des ATPDases en permettant de localiser ces enzymes. Les ATPDases sont des enzymes relativement peu connues et leurs fonctions mal identifiées, à l'exception d'un rôle dans l'agrégation plaquettaire que nous avons démontré in vitro. Cette seule fonction de l'enzyme est capitale puisqu'une agrégation plaquettaire mal contrôlée est à la base de maladies cardiovasculaires, telle la thrombose. En résumé, nous avons montré que les ATPDases sont les principales ectonucléotidases des cellules de mammifères, et nous en avons purifié deux isoformes. Ce sont des glycoprotéines que nous avons identifiées à CD39 humaine, dont nous avons cloné et réexprimé l'ADNc. Nous avons également produit plusieurs anticorps polyclonaux de différentes spécificités, dirigés contre ces protéines."--Résumé abrégé par UMI