Identification d'une nouvelle forme du facteur de transcription PLZF et implication dans le maintien de l'épithélium intestinal

• Main Author: Jones, Christine
• Other Authors: Boudreau, François
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 2007
• Online Access: http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/3880

PLZF est un répresseur transcriptionnel de la famille des facteurs à doigts de zinc. Il fut d'abord identifié comme protéine de fusion suite à une translocation chromosomique impliquée dans une forme rare de la leucémie promyélocytique aiguë, résistante aux différents traitements incluant l'acide rétinoïque. PLZF est impliqué dans le maintien des cellules souches spermatogoniales et dans le maintien de l'état indifférencié des cellules progénitrices myéloïdes. Nous avons par le passé identifié PLZF comme une cible du répresseur transcriptionnel colonique CDP. Le rôle de PLZF dans l'épithélium intestinal demeure toutefois inconnu. Notre hypothèse de départ était que PLZF pourrait être impliqué dans le contrôle de la prolifération de l'épithélium intestinal et dans le maintien de sa population souche. Un immunobuvardage de type Western a mené à la détection d'une forme écourtée de PLZF, soit d'environ 65 kDa, par rapport à la forme classique de 81 kDa. Une analyse détaillée du profil d'expression de PLZF dans diverses lignées cancéreuses colorectales humaines a démontré une forte expression de PLZF 65 kDa dans ces cellules, par rapport à l'expression dans les colonocytes foetaux. De plus, une diminution de l'expression de PLZF 65 kDa dans les cellules épithéliales intestinales quiescentes (HIEC) fut observée. Une diminution a également été observée à l'atteinte de la confluence des cellules Caco-2/15, suggérant à nouveau une implication de PLZF 65 kDa dans la prolifération cellulaire et/ou dans le maintien de l'état indifférencié de ces cellules. Trois hypothèses furent par la suite avancées pour expliquer l'origine de PLZF 65 kDa : l'épissage alternatif, le clivage protéolytique, et la traduction à partir d'un second site d'initiation de la traduction. Une expérience de RT-PCR avec les messagers de lignées cancéreuses colorectales humaines n'a pas menée à l'identification d'une forme épissée pouvant expliquer l'origine de PLZF 65 kDa. Le traitement de ces différentes lignées cancéreuses colorectales avec différents inhibiteurs de protéases a également permis de rejeter l'implication de plusieurs protéases dans la production de PLZF 65 kDa. Une analyse détaillée de la séquence de PLZF a menée à l'identification d'un second site d'initiation de la traduction parfaitement conservé en fonction de la séquence consensus de Kozak et en aval du site d'initiation connu. La transfection d'un vecteur d'expression éliminant le premier ATG de PLZF et une expérience de transcription/traduction in vitro ont résulté en la production d'une protéine de 65 kDa. Une expérience d'immunoprécipitation avec une protéine PLZF étiquetée Flag est venue appuyer l'hypothèse de l'utilisation d'un second site d'initiation de la traduction. Des analyses ont ensuite été effectuées afin de vérifier si l'absence du domaine de répression et de localisation nucléaire BTB-POZ dans PLZF 65 kDa permettait toujours la localisation de la protéine au niveau du noyau. L'analyse par Western des protéines extraites suite au fractionnement des cellules cancéreuses et des cellules épithéliales normales de souris a permis de constater que PLZF 65 kDa se retrouvait exclusivement au niveau du cytosquelette. Des co-immunolocalisations avec la cytokératine 18 ont ensuite confirmé cette observation. Cette étude a démontré l'existence d'une nouvelle forme de la protéine PLZF, originant de la traduction à partir d'un second site d'initiation situé en aval de l'ATG classique. Les résultats suggèrent également que cette nouvelle forme de PLZF ne posséderait pas le domaine de répression BTB-POZ et qu'elle pourrait être impliquée dans différents processus cellulaires tels que la prolifération et/ou le maintien de l'état indifférencié des cellules épithéliales intestinales.