Caractérisation de l'ARN de la télomérase chez la levure Saccharomyces cerevisiae

• Main Author: Lévesque, Nancy
• Other Authors: [non identifié]
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 2006
• Online Access: http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/3854

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques servant au maintien de l'intégrité des chromosomes. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, des répétitions télomériques TG[indice inférieur 1-3]/C[indice inférieur 1-3]A, se succèdent pour former un segment d'une longueur d'environ 300 pb. Le maintien de ces séquences répétées indispensables pour la stabilité du génome se fait par un enzyme appelé la télomérase. Cet enzyme est constitué de plusieurs sous-unités protéiques ainsi que d'une composante ARN servant de matrice pour l'addition des répétitions et d'échafaudage pour l'assemblage du RNP. La structure secondaire de l'ARN de la télomérase des ciliés et vertébrés a déjà été déterminée par analyse phylogénétique. Par contre, chez la levure, seulement de petits éléments structuraux ont été identifiés. La difficulté dans la détermination de la structure réside dans le fait que le bassin de population des ARNs pouvant être utilisés pour l'analyse est très faible et que l'ARN de la levure est d'une taille considérable (1 200 nt) comparativement aux ciliés (150 nt) et aux vertébrés (450 nt). Dans une première étude, nous avons élaboré un modèle de la structure secondaire de l'ARN de la télomérase TLC1. En premier lieu, il fallait trouver des souches qui avaient une distance évolutive appropriée par rapport à S. cerevisiae. Donc, les ARNs homologues de TLC1 provenant des souches « sensu stricto», ont été isolés et caractérisés par Northern blot. Puis, ils ont remplacé l'ARN TLC1 dans les souches de levure S. cerevisiae afin de déterminer la structure/fonction de ses ARNs. Par ailleurs, afin de faciliter l'alignement des ARNs nécessaire à l'analyse phylogénétique, la détermination de l'extrémité 5' a été effectuée comme point d'ancrage pour l'alignement. L'analyse phylogénétique nous a permis de suggérer un modèle de la structure de l'ARN TLC1 qui nous permettra de faciliter l'étude de la fonction et du mode d'assemblage de l'holoenzyme. Dans un deuxième temps, nous avons voulu poursuivre l'étude de la caractérisation de la structure secondaire mais aussi tertiaire de l'ARN de la télomérase. Un criblage de mutants sensibles au froid a été mis au point afin de d'identifier les interactions critiques de l'ARN TLC1. Ce criblage est basé sur le principe que certains changements spécifiques dans une molécule d'ARN peuvent provoquer une stabilisation d'interactions inappropriées qui à 18[degrés Celsius] provoquera la mort des cellules, mais qui permettra toujours aux cellules de survivre à 30[degrés Celsius]. Lors de cette étude, 10 mutants sensibles au froid ont été isolés sur 20 000 clones criblés. Les mutations introduites dans ces clones pourraient nous aider à améliorer notre compréhension du fonctionnement de l'enzyme. Finalement, la détermination d'un modèle de la structure secondaire de l'ARN de TLC1 a révélé de nouveaux sites potentiels de liaison de facteurs impliqués dans la structure/fonction de l'ARN. Nous avons donc tenté de mettre au point une méthode de purification de la télomérase qui utilise l'ARN comme appât. Cette technique qui avait déjà fait ses preuves pour un autre ARN, s'est avérée moins efficace qu'on le désirait pour l'ARN de TLC1. En effet, le taux d'enrichissement de TLC1 lors de la purification est trop faible pour parvenir à identifier de nouveaux partenaires.