Identification de rétropseudogènes dérivés des ARNs hY et étude de leur fonction dans l'épissage alternatif chez l'humain et recherche d'un homologue de la protéine RoBP1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae

• Main Author: Noël, Jean-François
• Other Authors: Boire, Gilles
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 2006
• Subjects: Rétrotransposition; Épissage; Pseudogène; RoBP1; ARN hY
• Online Access: http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/3825

Les ribonucléoprotéines Ro humaines sont constituées d'un des 4 ARNs hY et des protéines Ro60 et La, et probablement des protéines RoBP1, PTB et hnRNP K. Certaines maladies autoimmunes affectant les tissus conjonctifs sont caractérisées par la formation d'autoanticorps contre ces ribonucléoprotéines. Aucune fonction n'est attribuée aux RNPs Ro et leur rôle dans la pathogénèse des maladies qui sont associées aux anticorps ciblant ces RNPs reste indéfini. La protéine RoBP1 interagit spécifiquement avec les RNPs Ro contenant Ro60 et hY5.Les particularités biochimiques et immunologiques de ces RNPs Ro suggèrent une fonction particulière qui pourrait être découverte par une meilleure connaissance de la protéine RoBP1. Des travaux antérieurs tentant d'identifier l'homologue fonctionnel de RoBP1 chez la levure suggéraient l'existence de 2 gènes pouvant complémenter pour la perte de RoBP1 dans une souche de levure rendue dépendante de RoBP1. Nous avons confirmé la dépendance à RoBP 1 de cette souche. Cependant, les petites colonies sur milieu riche et l'absence de croissance sur milieu non-fermentable nous ont indiqué des déficiences respiratoires. Un rétrocroisement de cette souche avec une levure sauvage ne nous a pas permis de corriger ces déficiences. De plus, les tests de complémentation non concluants et l'absence de létalité des délétions des 2 gènes (UBC5 et CAF4) contredisent les travaux antérieurs. Donc, aucun homologue fonctionnel de RoBP1 n'est identifié chez la levure. Les gènes codants pour les ARNs hY semblent être présents en une seule copie par génome. Cependant, il existe une abondance de séquences homologues aux ARNs hY dans le génome humain.Les séquences répétées les plus représentées dans le génome proviennent des éléments transposables, dont le rétrotransposon L1. La machinerie de rétrotransposition de l'élément L1 peut être utilisée pour la mobilisation d'autres séquences, comme les éléments Alu, et cette rétrotransposition laisse des marques caractéristiques identifiables dans le génome. L'analyse approfondie des séquences hY génomiques pourrait permettre de découvrir leur origine. À l'aide d'outils bioinformatiques, nous avons identifié 966 pseudogènes dérivés des ARNs hY dispersés dans tous les chromosomes avec une préférence pour les régions riches en gènes. La conservation des séquences et la distribution génomique des pseudogènes hY sont similaires à ceux des éléments Alu et leur apparition serait survenue après la divergence des rongeurs et des primates. L'analyse des séquences nous a permis d'identifier plusieurs caractéristiques suggérant que les pseudogènes hY ont été mobilisés directement par la machinerie de rétrotransposition de L1: queue poly(A), duplications du site cible flanquant le pseudogène, et site d'insertion similaire au site consensus reconnu par l'endonucléase de l'élément L1. Nous avons identifié chez les pseudogènes hY certaines mutations ponctuelles spécifiques au niveau des sites de liaison aux protéines Ro60, La ou hnRNP K. Trois des protéines interagissant avec les RNPs Ro seraient impliquées dans l'épissage (PTB, hnRNP K et RoBP1). Des séquences homologues aux ARN hY se retrouvant dans des introns près de sites d'épissage pourraient recruter ces protéines et moduler l'épissage de l'intron. Nous avons introduit des séquences correspondant aux ARNs hY dans les introns de modèles d'épissage alternatif (hnRNP A1 et Bcl-x) pour vérifier leur impact sur l'épissage. Nous avons observé qu'une séquence hY3 en aval ou en amont de l'exon alternatif du modèle A1 favorise l'exclusion de cet exon; modulation qui est plus importante lorsque la séquence est dans l'orientation opposée au gène. Des expériences de compétition montrent cependant que cette modulation semble être indépendante de l'action d'un facteur agissant en trans . Dans certains cas, la modulation observée est atténuée par la présence dans le mélange d'épissage d'une séquence complémentaire. Contrairement au modèle A1, l'introduction de séquences hY3 introniques influence peu l'épissage in vitro et in vivo du mini-gène Bcl-x.