Détermination du rôle catalytique de résidus d'acides aminés présents dans le site actif de la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de muscle de lapin recombinante

• Main Author: Loisel, Thomas P.
• Other Authors: [non identifié]
• Language: French
• Published: Université de Sherbrooke 1992
• Online Access: http://hdl.handle.net/11143/12086

L'ADN complémentaire (cADN) de la fructose-1,6-bisphosphate aldolase (E.C. 4.1.2.13) de muscle de lapin recombinante, une enzyme de la glycolyse clivant réversiblement le fructose-1,6-bisphosphate (FDP) en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P), a été muté sur certains de ces résidus d'acides aminés conservés à travers l'évolution et situés au site actif de cette enzyme comme démontré par les études cristallographiques de diffraction des rayons X faites par Sygusch et al. (PNAS, (1987), 84, p. 7846-7850). Les protéines mutantes, produites lors de l'expression de ces cADN mutants dans la bactérie E. coli JM 83 constitutive, ont été purifiées jusqu'à homogénéité en utilisant une méthode modifiée dérivée de celle employée lors de la purification de l'enzyme native. Afin de déterminer le rôle, dans le mécanisme catalytique de l'aldolase de classe I, de ces résidus d'acide aminé mutés, nous avons mesuré la vitesse catalytique résiduelle des aldolases mutantes par dosage couplé au NADH, la vitesse d'oxydation de l'èneamine produite par l'enzyme avec un chromophore d'oxydoréduction: l'hexaferrocyanate III. De plus, des substrats naturels de l'enzyme, le FDP et le DHAP, ont été marqués spécifiquement avec du phosphore 32 dans le but de mesurer la quantité de différents intermédiaires de la réaction chez les mutants et de les comparer avec la quantité de ceux présents chez l'aldolase native. De ces données, intégrées à celles présentées dans la littérature et d'après des études de modélisation du substrat dans le site actif de l'aldolase, faites au laboratoire du Dr. Sygusch, il a été possible d'extraire suffisamment d'informations pertinentes à l'élaboration d'un modèle dans lequel chaque résidu d'acide aminé muté se voit attribuer un rôle précis dans le mécanisme catalytique de la réaction réversible de condensation aldolique.