| Summary: | [EN] This thesis deals with the development of a living biointerface between synthetic substrates and living cells to engineer cell-material interactions for tissue engineering purposes. This living biointerface is made of Lactococcus lactis, a non-pathogenic lactic bacteria widely used as starter in the dairy industry and, recently, in the expression of heterologous proteins in applications such as oral vaccine delivery or membrane-bound expression of proteins.
L. lactis has been engineered to display the III 7-10 fragment of the fibronectin fused to GFP as reporter protein. Fibronectin is a ubiquitous protein present in the extracellular matrix, a complex mesh of structural and adhesive proteins which serve as mechanical support and development niche for cells of a wide variety of tissues. This fragment contains two important sequences, RGD and PHSRN. RGD is an adhesive sequence that interacts with a wide range of integrins, membrane-bound receptors that play a role in cellular processes such as adhesion, migration, proliferation and differentiation. On the other hand, PHSRN binds synergistically with RGD to some integrins such as alpha-5-beta-1 and others, increasing the specificity of this interaction.
Genetically engineered L. lactis has been thoroughly characterized to test its capabilities as a living interface. This strain was found to express the FNIII 7-10-GFP fragment covalently linked to the cell wall and biological activity and expression levels of this fragment was assessed with techniques such as Western blot, ELISA and immunofluorescence. Moreover, this strain still holds the ability to develop biofilms, communities of sessile, attached bacteria to abiotic surfaces which helps greatly in the generation of a stable monolayer of bacteria between synthetic substrates and mammalian cells.
Mammalian cell behaviour in response to the expressed fibronectin fragment on L. lactis membrane was also assessed. Several cell lines were tested, such as Fn-/Fn- and NIH3T3 fibroblasts, C2C12 myoblasts and human bone-marrow derived mesenchymal cells. This living biointerface was found to trigger cell adhesion and FAK phosphorylation, a marker for intracellular integrin-mediated signalling in all of the tested cell lines. It also triggered myoblast-to-myotube differentiation on C2C12 cells. In hMSCs, the cell-wall exposed fibronectin fragment was found to enhance the phosphorylation of ERK1/2, a kinase involved in the MAPK pathway, which is deeply involved in a multitude of cellular processes related to differentiation, proliferation and migration.
Nevertheless, this thesis is a proof of concept that this novel system can be further exploited to express almost any desired protein or small molecule to help in the development of new tissues from progenitor cells. These molecules can be either secreted in the medium or displayed in the membrane, and can also be constitutively expressed or in-demand, due to the great flexibility of L. lactis and the wide variety of expression systems available.
This interface based on living bacteria establishes a new paradigm in surface functionalization for biomedical engineering applications. === [ES] Esta tesis aborda el desarrollo de una biointerfase viviente entre materiales sintéticos y células vivas con el objetivo de dirigir la interacción célula-material en aplicaciones de ingeniería tisular. Esta biointerfase está compuesta de Lactococcus lactis, una bacteria láctica no patógena, ampliamente usada en la industria láctea como inóculo, y, recientemente, en la expresión heteróloga de proteínas para su uso como vacunas de administración oral o su expresión en membrana.
L. lactis ha sido genéticamente modificado para expresar el fragmento III 7-10 de la fibronectina, unida a GFP como reporter. La fibronectina es una proteína presente de forma ubicua en la matriz extracelular, una compleja red de proteínas adhesivas y estructurales cuyo propósito es servir como soporte estructural y como nicho de desarrollo para diversos tejidos. Este fragmento contiene dos secuencias importantes, RGD y PHSRN. RGD es una secuencia adhesiva de unión que interacciona con una amplia variedad de integrinas, receptores de membrana que juegan muchos e importantes papeles en diferentes procesos celulares, como adhesión, proliferación, migración o diferenciación. Por otra parte, PHSRN se une a las integrinas de forma sinérgica con RGD facilitando aún más estos procesos y aumentando la especificidad de esta interacción.
Esta cepa de L. lactis modificada ha sido ampliamente caracterizada para estudiar su idoneidad como interfaz funcional viviente. Se ha demostrado que L. lactis es capaz de expresar el fragmento FNIII7-10-GFP covalentemente anclado a la pared celular bacteriana, habiéndose caracterizado también su actividad biológica con técnicas como Western blot, ELISA e inmunofluorescencia. Esta cepa mantiene la capacidad de desarrollo de biofilms presente en la gran mayoría de microorganismos. Los biofilms son comunidades de bacterias sésiles adheridas a un sustrato que pueden ser usadas como interfase física entre células de mamífero y sustratos abióticos.
También se ha estudiado la respuesta celular a la fibronectina expuesta en la membrana de L. lactis. Se estudiaron varias líneas celulares, como fibroblastos Fn-/Fn- y NIH3T3, mioblastos C2C12 y células mesenquimales humanas derivadas de médula ósea. Esta interfase viviente fue capaz de provocar respuesta celular en forma de adhesión en todas las líneas estudiadas, además de inducir diferenciación de mioblastos a miotubos en C2C12 y de provocar la fosforilación de FAK, un marcador de señalización celular mediada por integrinas.
En células mesenquimales humanas se demostró la capacidad del fragmento de fibronectina expuesto para fosforilar ERK1/2, una kinasa perteneciente a la ruta de señalización MAPK, ruta que forma parte de muchos procesos celulares importantes como diferenciación, proliferación y migración.
Pese a todo, esta tesis es sólo una prueba de concepto de un sistema que puede ser utilizado para expresar casi cualquier proteína o molécula pequeña deseada, que puede ser muy útil en el desarrollo de nuevos tejidos a partir de sus células progenitoras. Estas moléculas pueden ser secretadas en el medio o ancladas en la pared celular, de forma constitutiva o bajo demanda, debido a la flexibilidad y amplia variedad de sistemas de expresión disponibles para L. lactis.
Esta biointerfase basada en bacterias vivas establece un nuevo paradigma en el campo de la funcionalización de superficies para aplicaciones de ingeniería biomédica. === [CAT] Aquesta tesi aborda el desenvolupament d'una interfase viva entre materials sintètics i cèl·lules vives amb l'objectiu de dirigir la interacció cèl·lula-material, per al seu ús en aplicacions d'enginyeria tissular. Aquesta interfase està composta de Lactococcus lactis, un bacteri làctic, no patogènic i àmpliament utilitzat en l'industria làctica com a inòcul, i, recentment, en l'expressió heteròloga de proteïnes per al seu ús com vacunes d'administració oral o per a la seva expressió en membrana.
L. lactis ha sigut genèticament modificada per a expressar el fragment III7-10 de la fibronectina, unida a GFP com a reporter. La fibronectina és una proteïna present de forma ubiqua en la matriu extracel·lular, una complexa xarxa de proteïnes adhesives i estructurals que s'utilitzen com a suport estructural i com a nínxol de desenvolupament per a diversos teixits. Aquest fragment conté dos seqüències importants, RGD i PHSRN. RGD és una seqüència adhesiva d'unió a integrines, receptors de membrana que juguen molts i molt importants papers en diferents processos cel·lulars, com poden ser adhesió, proliferació, migració o diferenciació. Per altra banda, PHSRN s'uneix a les integrines de forma sinèrgica amb RGD facilitant encara més aquests processos i augmentant l'especificitat d'aquesta interacció.
Aquesta modificació genètica de L. lactis ha estat àmpliament caracteritzada per provar les seves característiques com a interfase funcional vivent. S'ha demostrat que L. lactis és capaç d'expressar el fragment FNIII 7-10-GFP covalentment ancorat a la paret cel·lular bacteriana, havent-se caracteritzat també la seva activitat biològica amb tècniques com Western blot, ELISA i immunofluorescència. A més, aquest cep manté la capacitat de desenvolupament de biofilms, comunitats de bacteris sèssils adherits a un substrat que poden ser utilitzades com a interfase física entre cèl·lules de mamífer i substrats abiòtics.
També s'ha estudiat la resposta cel·lular a la fibronectina expressada en la paret cel·lular de L. lactis. El estudi es va fer utilitzant diverses línies cel·lulars, com fibroblasts Fn-/Fn- i NIH3T3, mioblasts C2C12 i cèl·lules mesenquimals humanes derivades de medul·la òssia. Aquesta interfase vivent va ser capaç de provocar resposta cel·lular en forma d'adhesió a totes les línies estudiades, a més d'induir diferenciació de mioblasts a miotubs en C2C12 i de provocar la fosforilació de FAK, un marcador de senyalització cel·lular mediat per integrines, en les línies assajades. En cèl·lules mesenquimals humanes es va demostrar la capacitat del fragment de fibronectina exposat per fosforilar ERK1/2, una kinasa pertanyent a la ruta de senyalització MAPK, ruta que forma part de molts processos cel·lulars importants com diferenciació, proliferació i migració.
Malgrat tot, aquesta tesi mostra només una prova de concepte d'un sistema que pot ser utilitzat per expressar gairebé qualsevol proteïna o molècula petita desitjada, que pot ser molt útil en el desenvolupament de nous teixits a partir de les seves cèl·lules progenitores. Aquestes molècules poden ser secretades en el medi o ancorades a la paret cel·lular, de manera constitutiva o sota demanda, a causa de la flexibilitat i àmplia varietat de sistemes d'expressió disponibles per L. lactis
Aquesta biointerfase basada en bacteris vius estableix un nou paradigma en el camp de la funcionalització de superfícies per a aplicacions d'enginyería biomèdica. === Rodrigo Navarro, A. (2015). Functional living biointerfaces to direct cell-material interaction [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/51461 === TESIS
|
|---|
