| Summary: | Το Hypericum perforatum φύεται σε όλες τις εύκρατες περιοχές του πλανήτη. Τα υπέργεια τμήματά του συλλέγονται κατά την περίοδο της ανθοφορίας του και αποτελούν τη δρόγη του φυτού, η οποία συνήθως αποξηραίνεται. Υδροαλκοολικά του εκχυλίσματα, βάμματα και ελαιώδη εκχυλίσματα χρησιμοποιούνται κατά ψυχιατρικών παθήσεων και για την επούλωση πληγών και εγκαυμάτων. Η χρήση τους είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη, ιδιαίτερα στην κεντρική Ευρώπη.
Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία χρωματογραφική μέθοδος προσδιορισμού των κύριων βιοδραστικών συστατικών του H. perforatum. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε όργανο HPLC συζευγμένο με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (DAD) με χρήση χρωματογραφικής στήλης ανάστροφης φάσης C-18 και σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης τριών διαλυτών. Διαχωρίστηκαν πλήρως και προσδιορίστηκαν τα επικρατέστερα ποσοτικά συστατικά της δρόγης, δηλαδή: χλωρογενικό οξύ, ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκερσετίνη, κερσετίνη, διαπιγενίνη, ψευδοϋπερικίνη και υπερικίνη.
Η επικύρωση της μεθόδου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα εμβολιάζοντας ποσότητες προτύπων ενώσεων σε διάλυμα εκχυλίσματος H.perforatum συγκέντρωσης 0,5 mg/mL. Για καθένα από τα συστατικά αυτά (το χλωρογενικό οξύ, τη ρουτίνη, τον υπεροζίτη, την ισοκερσετίνη, την κερσετίνη και την υπερικίνη) κατασκευάστηκε η καμπύλη βαθμονόμησής του και όλες κατέδειξαν εξαιρετική γραμμικότητα. Η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της μεθόδου επικυρώθηκαν με έλεγχο της ικανότητας ανάκτησης των συστατικών (ακρίβεια) και με εκτίμηση της εγγύτητας των αποτελεσμάτων επαναλαμβανόμενων πειραμάτων (επαναληψιμότητα) σε τέσσερα επίπεδα συγκέντρωσης. Ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα λήφθηκαν τόσο σε πειράματα εντός της ίδιας μέρας όσο και μεταξύ δύο ημερών για όλα τα συστατικά, με εξαίρεση εκείνων του χλωρογενικού οξέος. Ο έλεγχος της σταθερότητας, διάρκειας 30 ημερών, έγινε σε τρία επίπεδα συγκεντρώσεων υπό διάφορες συνθήκες φύλαξης (θερμοκρασία δωματίου, ψυγείο, κατάψυξη). Κάθε συστατικό παρουσίασε διαφορετική συμπεριφορά, όλα όμως εμφάνισαν αξιοσημείωτη σταθερότητα ακόμη και 30 ημέρες μετά, όταν φυλάσσονταν στους -18 οC. Τέλος, ελέγχθηκε το μέγεθος του φαινομένου της μεταφοράς υλικού (carry over) μεταξύ των αναλυτικών κύκλων. Διαπιστώθηκε ότι η μεταφορά υλικού είναι σημαντική και πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στην αναλυτική διαδικασία όταν οι συγκεντρώσεις των συστατικών ξεπερνούν το ήμισυ του ULOQ.
Η εφαρμογή της μεθόδου έδειξε ότι στο μεθανολικό εκχύλισμα και το έγχυμα του H. perforatum τα κυριότερα συστατικά που προσδιορίστηκαν ήταν τα φλαβονοειδή, εκ των οποίων ο υπεροζίτης βρέθηκε σε μεγαλύτερες ποσότητες. Στο έγχυμα, αν και γενικότερα προσδιορίστηκαν μικρότερες ποσότητες των διαφόρων συστατικών, εντοπίστηκε και χλωρογενικό οξύ το οποίο απουσιάζει από το μεθανολικό εκχύλισμα. Στο μεθανολικό εκχύλισμα της πόας H.vesiculosum κυριότερη ομάδα συστατικών εμφανίζονται τα φλαβονοειδή, με την ισοκερσετίνη και διαπιγενίνη σε μεγαλύτερες ποσότητες.
Όσον αφορά στο έλαιο H. perforatum εξετάστηκαν δύο εκχυλιστικές μέθοδοι οι οποίες και ελέγχθηκαν ως προς την αποτελεσματικότητά τους. Στην πρώτη μέθοδο πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με χρήση ενός υδατικού διαλύματος και στη δεύτερη με χρήση οξειδίου του πυριτίου ως προσροφητικό υλικό. Αν και καμία δεν είχε ικανοποιητική απόδοση εκχύλισης όπως εδείχθη με προσδιορισμό της ανάκτησης από εμβολιασμένα δείγματα, τα συστατικά που προσδιορίστηκαν σε δύο διαφορετικά έλαια είναι τα φλαβονοειδή κερσετίνη και διαπιγενίνη καθώς και η ναφθοδιανθρόνη ψευδοϋπερικίνη. === Hypericum perforatum has a cosmopolitan distribution in temperate regions. The aereal parts of the plant are collected during the flowering stage, they are dried and they constitute the drug. The most common preparations are the water-alcohol extracts, tinctures and oily extracts and they are used against psychiatric conditions as well as for wound and burn healing. H. perforatum extracts are so widely used, especially in central Europe, that they are among the most popular formulations against depression.
In the current master thesis a chromatographic method for the determination of the major bioactive constituents of H.perforatum was developed and validated. This validated method was applied in methanol extract, infusion and oily extract (Hypericum oil) of the herb. The chromatographic separation was performed using a HPLC instrument coupled with a photo diode array detector (DAD) and a C-18 reverse phase (RP) column in a three solvent multistep gradient program. The identified constituents were: chlorogenic acid, rutin, hyperoside, isoquercetin, quercetin, biapigenin, pseudohypericin and hypericin. All of them were completely resolved.
The method was validated in accordance with international standards using spiked quantities of standard solutions of chrorogenic acid, rutin, hyperoside, isoquercetin, quercetin and hypericin in a 0,5 mg/mL H.perforatum extract solution. For each of the above constituents a calibration curve was constructed and all of them have shown great linearity. For each constituent the lower and upper limit of quantification (LLOQ and ULOQ) was estimated. The accuracy and precision of the method were determined in four concentration levels. Accurate and precise results were obtained in both intra and interday (between two days) experiments for every constituent, with the exception of chlorogenic acid. The stability test (30 days duration), was performed in three concentration levels under different storage conditions (room temperature, fridge, refrigerator). Every constituent had a different stability behavior, all of them, though, were found having notable stability even after 30 days, when stored at -18 οC. Finally, the carry over effect between analytical circles was estimated. The carry over effect was significant and should be taken into consideration when concentrations are higher than half the ULOQ.
The chemical composition of three H. perforatum preparations (methanol extract, infusion, Hypericum oil) and one H.vesiculosum preparation (methanol extract) was investigated. The major constituents, identified in the methanol extract and the infusion of H. perforatum, were the flavonoids, while hyperoside was found in greater amounts among them. Though, smaller amounts of the constituents were identified in the infusion, chlorogenic acid was present, in contrast with the methanol extract. In the methanol extract of H.vesiculosum the flavonoids were found the major group of constituents, with isoquercetin and biapigenin in larger quantities.
Regarding the H. perforatum oil, two kinds of extractions were performed and evaluated for their efficiency. In the first one, the extraction was performed using an aqueous solution and the second one using silicon dioxide as an absorptive material. Even though neither extraction was efficient as was proved by recovery test of spiked samples, the constituents identified in two different oil preparations were the flavonoids quercetin and biapigenin and the naphthodianthrone pseudohypericin.
|
|---|
