Φαρμακοδυναμική μελέτη συνθετικού αντικαρκινικού πεπτιδίου και βελτίωση της in vivo σταθερότητας με σύνδεση με πολυαιθυλενογλυκόλη

• Main Author: Μπαμπούρη, Ιωάννα
• Other Authors: Σιβολαπένκο, Γρηγόρης
• Language: gr
• Published: 2014
• Subjects: Πολυαιθυλενική γλυκόλη; Σταθερότητα πεπτιδίου; 615.761; Polyethylene glycol (PEG); Peptide stability; PCK3145
• Online Access: http://hdl.handle.net/10889/6604

Η συσχέτιση της πρωτεΐνης PSP94 με τον καρκίνο του προστάτη είναι γνωστή, καθώς μειωμένα επίπεδα της PSP94 σχετίζονται με τα προχωρημένα, μεταστατικά στάδια καρκίνου του προστάτη, και υποτίθεται ότι η πλήρης έκφρασή της συμβάλλει στην αναχαίτιση της καρκινικής ανάπτυξης. Το PCK3145, ένα συνθετικό δεκαπενταμερές πεπτίδιο, του οποίου η αλληλουχία αμινοξέων είναι ταυτόσημο με την αλληλουχία των αμινοξέων 31 έως 45 της PSP94, επιλέχτηκε μεταξύ 12 διαφορετικών πεπτιδίων που προέκυψαν από την PSP94 καθώς εδείχθη οτι ανακεφαλαιώνει in vitro και in vivo τις λειτουργίες και ιδιότητες της PSP94, και άρα είναι ένα μόριο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην καταστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, φαρμακοκινητικές μελέτες σε ζώα και ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, κατέδειξαν ταχεία κάθαρση και μικρό χρόνο ημιζωής. Προκειμένου να ενισχυθεί το φαρμακοκινητικό προφίλ του πεπτιδίου PCK3145 και ως εκ τούτου να βελτιωθεί η φαρμακοδυναμική του, υπέστη χημική τροποποίηση με προσθήκη πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG). Η πειραματική εργασία παρουσιάζει τα αποτελέσματα μιας συστηματικής μελέτης σχετικά με την επίδραση της πεγκυλίωσης στο PCK3145 συγκρίνοντας την πρωτεολυτική σταθερότητα και βιολογική δράση δύο πεγκυλιωμένων συζευγμάτων του με την καθαρή μορφή του. Για την ποσοτικοποίηση και για τα πειράματα σταθερότητας χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης HPLC αποτελούμενο από μια αντλία Ultimate (Dionex). Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός επιτεύχθηκε με μια στήλη ανάστροφης φάσης C18. Επετεύχθη για πρώτη φορά η ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας HPLC για τον προσδιορισμό των πεγκυλιωμένων αναλόγων με υψηλού βαθμού γραμμικότητα, ειδικότητα, επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα. Η πρωτεολυτική σταθερότητα των συζευγμάτων PEG σε ανθρώπινο πλάσμα προσδιορίστηκε με χρήση υγρής χρωματογραφίας HPLC και αποκαλύφθηκε μείωση του ποσοστού αποδόμησης και ενίσχυσξ της σταθερότητας του πεπτιδικών μορίων σε ανθρώπινο πλάσμα. H μελέτη επιβίωσης της κυτταρικής σειράς καρκίνου του προστάτη PC3 μετά την προσθήκη των πεπτιδικών μορίων υπό μελέτη υπολογίστηκε με τις μεθόδους ΜΤΤ και Trypan blue. 50% αναστολή της κυτταρικής αύξησης/μεταβολισμού επετεύχθη με τις συγκεντρώσεις των 10μg/ml και για τα τρία πεπτίδια. Ωστόσο, τα πεγκυλιωμένα ανάλογα επέφεραν ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση στην κυτταρική αύξηση σε μικρότερες δόσεις. Παρόμοια ενθαρρυντικά αποτελέσματα υπήρξαν και για την δράση των μορίων στη καρκινική σειρά του μαστού MCF-7. Τα αποτελέσματα της μελέτης συνοψίζονται στην ικανότητα της πεγκυλίωσης να βελτιώνει τη σταθερότητα του PCK3145 και έτσι να ενισχύει τη βιολογική του δράση. Μελλοντικά πειράματα θα αποσαφηνίσουν περισσότερο τόσο την δράση των μορίων σε καρκινικές σειρές πέραν του προστάτη αλλά και την φαρμακοκινητική συμπεριφορά των πεπτιδικών αναλόγων μέσω πειραμάτων in vivo της βιοκατανομής και μεταβολισμού τους. === PSP94, protein is known to have specific implications with prostate cancer where a down-regulation of PSP94 levels is associated with advanced metastatic prostate cancer and it is supposed that the full expression contributes to the inhibition of tumor growth. PCK3145 is a synthetic 15-mer peptide that matches the natural sequence of amino acids 31 to 45 of PSP94 and was selected from 12 other peptides derived from PSP94 as it exhibited the best in vitro and animal in vivo properties similar to PSP94. Thus, it is a molecule hat can be used to suppress the growth of prostate cancer.However pharmacokinetics studies in animals and in patients with prostate cancer showed rapid clearance and a short half-life. In order to alter the pharmacokinetic profile of the peptide, and thereby to improve its pharmacodynamic potential PCK3145 was chemically modified with polyethylene glycol (PEG).This experimental work presents the results of a systematic study on the influence of the PEGylation of PCK3145 peptides on the proteolytic stability and biological activity of these conjugates compared to the wild-type peptide. For the quantification and stability assays an HPLC system was used consisted of an Ultimate 3000 Pump (Dionex). Chromatographic separation was achieved on RP, C18 column. An HPLC method development for the determination of the PEG-peptide conjugates was assessed for the first time. A high degree of linearity, specificity as well as repeatability and reproducibility were also achieved. The proteolytic stability of the PEG-peptide conjugates in human plasma was assessed by HPLC chromatography, which revealed a significant decrease in the degradation. Proliferation of PC3 cancer cell line was measured using the MTT and Trypan blue test. A 50% inhibition of the cell metabolism/growth was achieved by the concentrations of 10 μg/ml of the three peptides. However, at lower concentrations stronger growth inhibitory effect was observed for the PEG-peptides. Similar encouraging results have also seen for the action of molecules in cancer cell lines MCF-7.The results of this study emphasize the ability of PEGylation to improve the stability of PCK3145 and thus to enhance the biological activity. Future experiments willi clarify more the action of molecules in cancer cell lines beyond the prostate and the pharmacokinetic behavour of peptide analogs through in vivo experiments of biodistribution and metabolism.