Παρασκευή και μελέτη σταθερότητας ανοσολιποσωμάτων με μονοκλωνικό αντίσωμα OX26 και πεπτίδια ApoE3 στην επιφάνειά τους

• Main Author: Παπαδιά, Κωνσταντίνα
• Other Authors: Αντιμησιάρη, Σοφία
• Language: gr
• Published: 2013
• Subjects: Λιποσώματα; Διπλή στόχευση; 571.655; Liposomes; Dual targeted
• Online Access: http://hdl.handle.net/10889/6057

Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η παρασκευή και μελέτη λιποσωμάτων διπλής στόχευσης με το μονοκλωνικό αντίσωμα Ox-26 και με πεπτιδικό ανάλογο της Απολιποτρωτεΐνης Ε3 (ApoE3) στην επιφάνειά τους, για στόχευση των υποδοχέων της τρανσφερρίνης (TfR) και της Απολιποτρωτεΐνης (LDL) αντίστοιχα, και η μελέτη πιθανής συνεργικής δράσης των δύο προσδετών. Για την ακινητοποίηση των προσδετών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων, χρησιμοποιήθηκαν δύο μεθοδολογίες. Η αλληλεπίδραση βιοτίνης-στρεπταβιδίνης-βιοτινυλιωμένου αντισωματος για την πρόσδεση του Ox-26 και η τεχνική της δημιουργίας θειοαιθερικού δεσμού (μέσω πρόσδεσης της κυστεΐνης του πεπτιδίου σε ομάδα μαλεϊμίδιου που υπάρχει σε λιπιδικό παράγωγο πολθαιθυλενογλυκόλης, το οποίο προστίθεται στη λιπιδική μεμβράνη κατα τη διάρκεια παρασκευής των λιποσωμάτων). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε η απόδοση της πρόσδεσης αυτών, ακολουθώντας δύο πορείες με σκοπό την επίτευξη μέγιστης πρόσδεσης και για τους δύο προσδέτες. Τα λιποσώματα χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος, το ζ-δυναμικό, καθώς και τη σταθερότητά τους παρουσία πρωτεϊνών ορού. Το μέσο μέγεθος των λιποσωμάτων προσδιορίστηκε μεταξύ 150-200nm. Τόσο το μέγεθος, όσο και η σταθερότητα των λιποσωμικών μορφώμ Πραγματοποιήθηκαν μελέτες πρόσληψης με τη χρήση ανθρώπινων αθανατοπιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων του εγκεφάλου, hCMEC/d3, όπου η πρόσληψη των λιποσωμάτων που φέρουν και τους δύο προσδέτες παρουσιάζεται μεγαλύτερη συγκριτικά με τα λιποσώματα που φέρουν μόνο έναν προσδέτη στην επιφάνεια τους, όπως επίσης και σε σύγκριση με απλά λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας στο αίμα, που δεν φέρουν κανένα ειδικό προσδέτη. Πραγματοποιήθηκαν, επίσης, μελέτες τοξικότητας όλων των λιποσωμικών μορφών, οι οποίες απέδειξαν πως όλοι οι τύποι λιποσωμάτων που αναπτύχθηκαν δεν εμφανίζουν τοξικότητα προς τα κύτταρα, σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές στις οποίες πραγματοποιήθηκαν τα in vitro πειράματα, αποδεικνύοντας ότι το πειραματικό αποτέλεσμα (αυξημένη πρόσληψη των λιποσωμάτων με διπλό σύστημα προσδετών από κύτταρα του εγκεφάλου) δεν οφείλεται σε τοξικότητα. Τελικό συμπέρασμα της παρούσας διατριβής είναι ότι η χρήση δύο διαφορετικών προσδετών στο ίδιο λιπόσωμα προσφέρει μεγαλύτερη ικανότητα στόχευσης του αιματεγκεφαλικού φραγμού, και πιθανώς μεγαλύτερη δυνατότητα διαπέρασης στον εγκέφαλο. === The aim of this study is the preparation of dually decorated liposomes with Ox26 monoclonal antibody and ApoE 3 derivative peptide on their surface and the investigation of a higher targeting potential of Blood Brain Barrier (BBB), as they are targeting both transferrin (Tfr) and apolipoprotein (LDLr) receptors. Two methods were used for the preparation of dually decorated liposomes. Biotin-streptavidin-biotinilated Mab, for Ox26 aattachement, and maleimide-cysteine-peptide for attachment of the ApoE3 peptide derivative. Two procedures were followed in order to achieve high attachment yield of both ligands, as calculated by ELISA technique for Ox26 and fluorescence intensity for ApoE. All types of liposomes were characterized for their size, z-potential and their stability in PBS or in the presence of serum proteins. Mean diameter of all types of liposomes was between 150-200nm, and their integrity and stability were found to be adequate for in vivo use. Uptake studies were performed by using hCMEC/d3 cell line. The uptake of ApoE liposomes or Ox26 liposomes, is demonstrated to be higher compare to the uptake of plain pegylated liposomes, while the uptake is further increased when both two ligands are immobilized on the same vesicle. MTT studies were also performed for all types of liposomes and proved that all the liposomal types developed herein were non toxic for the cells, in the same conditions as used in all in-vitro studies.