Ανάλυση αιθερίων ελαίων διαφορετικών taxa του γένους Crocus

• Main Author: Πιτσή, Ευθυμία
• Other Authors: Λάμαρη, Φωτεινή
• Language: gr
• Published: 2013
• Subjects: Αιθέρια έλαια; Γένος Crocus; 547.71; Essential oils; Genus Crocus
• Online Access: http://hdl.handle.net/10889/5913

Ο Κρόκος είναι πολυετές, βολβώδες φυτό, το οποίο ανήκει στην οικογένεια των ιριδοειδών και ευδοκιμεί στην νότια Ευρώπη και την νοτιοδυτική Ασία. Πιο συγκεκριμένα, στην Ελλάδα φύονται 23 είδη από τα οποία τα 10 είναι ενδημικά, πέντε εκ των οποίων εντοπίζονται στην Πελοπόννησο και ένα στην Κρήτη, όπου φύονται συνολικά 5 είδη. Το κυριότερο και περισσότερο μελετημένο είδος είναι ο Crocus sativus Linnaeus, που καλλιεργείται στην περιοχή της Κοζάνης. Τα αποξηραμένα υπέργεια τμήματα των στύλων, εκτός από τις αρτυματικές και χρωστικές τους ιδιότητες, αποτελούν επίσης σημαντική φαρμακευτική δρόγη. Διαθέτουν μεγάλη περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο για το οποίο η βιβλιογραφία είναι ιδιαίτερα εκτενής, με την σαφρανάλη να ανιχνεύεται ως το επικρατέστερο συστατικό. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας είναι η παραλαβή των αιθερίων ελαίων από στύλους τεσσάρων διαφορετικών ειδών του γένους Crocus, C.sativus L. (καλλιεργούμενο είδος της Κοζάνης), C.cartwrightianus Herbert, C.oreocreticus Burtt, C.laevigatus Bory & Chaub (αυτοφυή είδη της Κρήτης) και η ανάλυση αυτών, με απώτερο στόχο τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των συστατικών τους, καθώς επίσης την μεταξύ τους σύγκριση. Για την απομόνωση των αιθερίων ελαίων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της εκχύλισης σε λουτρό υπερήχων (USE) για 10 λεπτά επί 5 φορές, με σύστημα διαλυτών νερό – διαιθυλαιθέρα και αναλογία δρόγης προς διαλύτη 200mg/10mL. Ακολούθησαν διαδοχικές εκχυλίσεις στην διαχωριστική χοάνη για την απομόνωση της οργανικής φάσης, η οποία έπειτα ξηράνθηκε και συμπυκνώθηκε με αέριο άζωτο μέχρι τελικού όγκου 5mL. Η ανάλυση των αιθερίων ελαίων πραγματοποιήθηκε με χρήση αέριας χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας (Gas Chromatography - Mass Spectrometry, GC – MS) [στήλη: HP – 5MS capillary column (30m x 0,25mm, 0,25μm), φέρον αέριο: He] και με την βοήθεια των λογισμικών Msdchem και MestReNova v.6.0.2 – 5475, ενώ η αναλυτική μεθοδολογία ανευρίσκεται στην βιβλιογραφία [Kanakis et al. 2004]. Ο ποιοτικός προσδιορισμός των συστατικών πραγματοποιήθηκε με βάση το πρόγραμμα Nist MS Search v.2.0, τον δείκτη κατακράτησης (Kovats Index), την χρήση εξωτερικών προτύπων και την βιβλιογραφία. Για την ποσοτικοποίηση των συστατικών χρησιμοποιήθηκαν εξωτερικά πρότυπα υψηλής καθαρότητας, συγκεκριμένα η σαφρανάλη (>88%), η ισοφορόνη (97%) και η β–ιονόνη (>98%), ενώ το βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (ΒΗΤ, >99% καθαρότητα) αποτέλεσε το εσωτερικό πρότυπο. Η ανάλυση των αιθερίων ελαίων των ειδών C.sativus, C.cartwrightianus, C.οreocreticus και C.laevigatus οδήγησε στην ανίχνευση συνολικά 26, 15, 17 και 17 συστατικών αντιστοίχως. Στο είδος C.sativus η σαφρανάλη αποτελεί το κυριότερο συστατικό, ενώ επίσης σε σημαντικές ποσότητες εντοπίζονται η 4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλ-1-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (HTCC) και η ισοφορόνη. Στα είδη C.cartwrightianus και C.oreocreticus επικρατέστερη είναι η HTCC, ενώ η ισοφορόνη εμφανίζεται ως κύριο συστατικό στο είδος C.laevigatus. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα της χρωματογραφικής ανάλυσης από τα τέσσερα είδη Crocus, παρατηρείται μεγάλη ομοιότητα αναφορικά με την ποιοτική τους σύσταση. Ωστόσο, εντοπίζονται λιγότερα συστατικά και σε μικρότερες ποσότητες στα αυτοφυή είδη, συγκριτικά με το είδος C.sativus. Έτσι, στην συγκεκριμένη εργασία, η οποία συμβάλει στην φαρμακογνωστική μελέτη του γένους Crocus, απομονώθηκαν και αναλύθηκαν για πρώτη φορά αιθέρια έλαια taxa διαφορετικών από το ευρέως εξεταζόμενο είδος. Επίσης, στοχεύοντας στην σύγκριση της ποιοτικής σύστασης των υδατικών φάσεων, που είχαν συλλεχθεί κατά την απομόνωση των αιθερίων ελαίων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση αυτών με χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector, HPLC - DAD) [χρωματογραφική στήλη ανάστροφης φάσης: Luna C–18, (250mm x 4,6mm, 5μm)] και με την βοήθεια του λογισμικού Chromeleon v.6.80. Ο διαχωρισμός των συστατικών πραγματοποιήθηκε με χρήση συστήματος βαθμιδωτής έκλουσης με δύο διαλύτες: μεθανόλη/νερό παρουσία παγόμορφου οξικού οξέος 1% ν/ν, σε θερμοκρασία δωματίου με ροή 0,7mL/min και μέτρηση της απορρόφησης στα 250nm, 308nm και 440nm, ενώ η αναλυτική μεθοδολογία είναι προτεινόμενη από τους Tarantilis et al. (1995) και τροποποιημένη από τους Chryssanthi et al. (2007). Ως πρότυπο για τις αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε υδραλκοολικό (νερό – μεθανόλη, 1:1) εκχύλισμα (αναλογία δρόγης / διαλύτη: 50mg/3mL) των αποξηραμένων στύλων του C. sativus (τελικής συγκεντρώσεως 1mg/mL). Σύμφωνα με τα ληφθέντα αποτελέσματα, διαπιστώθηκε ότι στα χρωματογραφήματα των 4 ειδών Crocus στα εξεταζόμενα μήκη κύματος παρατηρούνται αρκετές ομοιότητες. Το γεγονός ότι το είδος C.oreocreticus, παρουσιάζει ταυτόσημο αποτύπωμα στα 440nm με το είδος C.cartwrightianus υποδεικνύει ενδεχομένως ότι το πρώτο είναι υποείδος του δεύτερου. Επιπλέον, διερευνήθηκε η αντιμικροβιακή δράση του αιθερίου ελαίου του είδους C.sativus, καθώς επίσης της σαφρανάλης και της ισοφορόνης, οι οποίες αποτελούν κύρια συστατικά των αιθερίων ελαίων όλων των εξεταζόμενων ειδών, έναντι τριών ειδών Gram-(+) βακτηρίων: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus spp. και τριών ειδών Gram-(-) βακτηρίων: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis. Για τον σκοπό αυτό, αναπτύχθηκαν καλλιέργειες των Gram-(+) βακτηρίων και Gram-(-) βακτηρίων σε αιματούχο άγαρ και Mac Conkey άγαρ αντιστοίχως, από τις οποίες παρασκευάστηκαν κυτταρικά εναιωρήματα σε φυσιολογικό ορό, τελικής συγκέντρωσης 105 βακτηριακά κύτταρα/mL. Για τον έλεγχο της ευαισθησίας των παθογόνων μικροοργανισμών και τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) χρησιμοποιήθηκε η μικρομέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων σε θρεπτικό ζωμό. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν πλάκες μικροτιτλοποίησης 96 βυθισμάτων, όπου το κυτταρικό εναιώρημα (100μL) επωάστηκε για 24 ώρες στους 37οC σε θρεπτικό ζωμό (100μL) διαβαθμιζόμενης συγκέντρωσης (υποδιπλάσιων αραιώσεων) σε αιθέριο έλαιο ή στο αντίστοιχο συστατικό. Ειδικότερα, οι αρχικές συγκεντρώσεις του αιθερίου ελαίου του C. sativus, της σαφρανάλης και της ισοφορόνης ήταν 2mg/mL, 850mg/mL και 894mg/mL αντιστοίχως. Σύμφωνα με τα πειραματικά αποτελέσματα, το αιθέριο έλαιο δεν προκάλεσε καμία αντιμικροβιακή δράση, γεγονός πιθανώς οφειλόμενο στην χαμηλή αρχική του συγκέντρωση (2mg/mL). Ενώ, η σαφρανάλη και η ισοφορόνη, εμφάνισαν αξιόλογη αντιμικροβιακή δράση έναντι των εξεταζόμενων βακτηρίων. Πιο συγκεκριμένα, αναφορικά με τα Gram-(+) βακτήρια, η MIC της σαφρανάλης προσδιορίστηκε στα 6mg/mL έναντι των Staphylococcus aureus και Staphylococcus epidermidis και στα 13mg/mL έναντι του Enterococcus spp.. Οι αντίστοιχες τιμές MIC της ισοφορόνης είναι 7mg/mL για τα δύο πρώτα και 14mg/mL για το τελευταίο. Ελέγχοντας την ευαισθησία των Gram-(-) βακτηρίων, η MIC της σαφρανάλης προσδιορίστηκε στα 13mg/mL έναντι της Escherichia coli και στα 27mg/mL έναντι των Klebsiella pneumoniae και Proteus mirabilis. Αντίστοιχα για την ισοφορόνη οι τιμές MIC είναι 14mg/mL για το πρώτο και 28mg/mL για τα δύο τελευταία. === --