Λιποσώματα με εξειδίκευση για τα πεπτίδια Αβ και για στόχευση των υποδοχέων τρανσφερρίνης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού

• Main Author: Μαρκουτσά, Ελένη
• Other Authors: Αντιμησιάρη, Σοφία
• Language: gr
• Published: 2011
• Subjects: Λιποσώματα; Αιματοεγκεφαλικός φραγμός; 571.655; Liposomes; Blood brain barrier
• Online Access: http://hdl.handle.net/10889/4800

Η παρούσα εργασία εστιάζει στην παρασκευή και μελέτη ανοσολιποσωμάτων είτε για στόχευση των υποδοχέων τρανσφερρίνης του ΑΕΦ είτε με εξειδίκευση για τα Αβ πεπτίδια. Για την πρόσδεση των αντισωμάτων στην επιφάνεια των λιποσωμάτων εφαρμόσαμε μια τεχνική βασισμένη στο σύστημα πρόσδεσης βιοτίνης/στρεπταβιδίνης. Έχει πρόσφατα προταθεί ότι νανοσυστήματα που φέρουν πολλόυς προσδέτες στην επιφάνεια ίσως είναι πιο κατάλληλα για στόχευση ασθενειών ή βιολογικών φραγμών. Σε αυτές τις περιπτώσεις πρέπει να διασφαλιστεί ότι η ικανότητα στόχευσης ενός προσδέτη δεν θα επηρεαστεί από την παρουσία και δευτερου. Σκοπός είναι η παρασκευή ΟΧ-26 (κατά του υποδοχέα τρανσφερρίνης μονοκλωνικό αντίσωμα) νανολιποσωμάτων, η μελέτη διαφόρων παραγόντων κατά την παρασκευή τους και οι μελέτες πρόσληψης από μοντέλο του ΑΕΦ. Ο συγκεκριμένος τύπος ανοσολιποσωμάτων επιλέχθηκε γιατί είναι γνωστό ότι στοχεύουν σε κύτταρα που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα της τρανσφερρίνης (TfR). Πρώτος στόχος είναι η παρασκευή ανοσολιποσωμάτων που φέρουν προσδεδεμένο στην επιφάνεια το μονοκλωνικό αντίσωμα ΟΧ-26 που στοχεύει στον υποδοχέα της τρανσφερρίνης και έγιναν μελέτες της πρόσληψης των ΟΧ-26 ανοσολιποσωμάτων από την αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά hCMEC/D3. Εκτός από τις μελέτες πρόσληψης έγιναν και μελέτες κυτταρικού εντοπισμού του περιεχομένου των λιποσωμάτων με σκοπό να διασαφηνίσουμε το μηχανισμό πρόσληψης. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η πρόσληψη των ανοσολιποσωμάτων από τα κύτταρα hCMEC/D3 είναι αρκετά υψηλή σε σύγκριση με την πρόσληψη ανοσολιποσωμάτων που φέρουν IgG αντίσωμα στην επιφάνειά τους. Επίσης, η δέσμευση είναι δοσοεξαρτώμενη και εξαρτάται και από την ποσότητα του αντισώματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων. Οσον αφορά στον μηχανισμό πρόσληψης τα αποτελέσματα δείχνουν ότι έχουμε λυσοσωματικό εντοπισμό του περιεχομένου των λιποσωμάτων συνεπώς μπορούμε να ισχυριστούμε ότι η πρόσληψη γίνεται μέσω υποδοχέα και ακολουθεί μεταφορά στα λυσοσώματα. Δεύτερος στόχος είναι η παρασκευή λιποσωμάτων με εξειδίκευση για τα Αβ πεπτίδια. Παρασκευάστηκαν λιποσώματα που φέρουν κουρκουμίνη εγκλωβισμένη στη λιπιδική διπλοστιβάδα και μελετήθηκε η ικανότητα τους να αναστέλουν τη συσσωμάτωση Αβ1-40 μονομερών ή ολιγομερών ή και να αποσσυσωματώνουν ινιδικές μορφές του Αβ1-42 πεπτιδίου. Για τον λόγο αυτό εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο θειοφλαβίνης Τ, με τη χρήση του οποίου μπορούμε να ανιχνεύουμε την ύπαρξη β-δομών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η λιποσωμική κουρκουμίνη έχει μεγαλύτερη ικανότητα αναστολής της συσσωμάτωσης και αποσσυσωμάτωσης των δομών των Αβ πεπτιδίων σε σύγκριση με την ίδια ποσότητα ελεύθερης κουρκουμίνης. Παρασκευάστηκαν επίσης και αnti-Abeta ανοσολιποσώματα και έγιναν μελέτες προσδιορισμού της συγγένειας πρόσδεσης αυτών σε ακινητοποιημένα μονομερή Αβ πεπτίδια καθώς και σε ινίδια με την τεχνική SPR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συγγένεια πρόσδεσης των ανοσολιποσωμάτων στα Αβ πεπτίδια και ινίδια είναι υψηλή καθώς και ότι η σταθερά δέσμευσης των ανοσολιποσωμάτων στα Αβ πεπτίδια εξαρτάται από την ποσότητα του αντισώματος στη λιποσωμική επιφάνεια. === This work focuses on the manufacture and study of immunoliposomes either for targeting of transferrin receptors of blood Brain Barrier or with specialization for Aβ peptides. For the attachment of antibodies in the surface of liposomes applied a technique based on the biotin/streptavidin linkage. It has been recently proposed that perhaps multiligant-decorated nanosystems may be more efficient to target specific diseases or biological barriers.insuch cases,it is important to be sure that the targeting potential of one ligand will not be negatively affected by the presence of the second on the same nanosystem. OX-26 (anti-transferrin momoclonal antibody) nanoliposomes werw prepared and after evaluation of several preparative aspects their brain targeting potential was studied on a cellular model of BBB. Manufactured pegylated immunoliposomes coated with the monoclonal antibody OX-26 aimed transferrin receptor and studies of uptake of OX-26 immunoliposomes from cell line hCMEC/D3 were done. Also studies of cell tracking content of immunoliposomes were done in order to clarify the mechanism of intake. Our results showed that the uptake of immunoliposomes from hCMEC/D3 cell line is quite high in comparison with the uptake of immunoliposomes coated with IgG antibody. Moreover the uptake of immunoliposomes is dosedependent and depends on the quantity of antibody in the liposomal surface. With regard to the mechanism of intake, results show that there is lysosomatic localization of the liposomal content so we can say that uptake is achievied through receptor and then followed shipment to lysosomes. In the second part, manufactured liposomes and immunoliposomes with specialization for Ab peptides. In the first case prepared liposomes with curcumin incorporated into the lipid bilayer and the ability to inhibit the linking of Aβ1-40 monomers or oligomers or even to disagreggate fibrillar forms of Aβ1-42 peptide was studied. For this purpose applied the thioflavin–T protocol, using which we can prove the existence of β-structures. The results showed that liposomal curcumin is more capable to inhibit the agreggation or to disaggregate structures of Aβ peptides compared with the same amount of free curcumin. In the second case, prepared anti-Abeta immunoliposomes and studies for the determination of the affinity for immobilized Aβ peptides monomers and fibrils were done with the SPR technique. The results showed that the affinity of immunoliposomes for Aβ monomers and fibrils is high and that the Ka of immunoliposomes in Aβ peptides depends on the amount of antibodies that is tethered on the liposomal surface.