Επίδραση ριβοσωματικών μεταλλάξεων στη δραστικότητα της τελιθρομυκίνης, ενός αντιβιοτικού νέας γενιάς

• Main Author: Κωστοπούλου, Ουρανία
• Other Authors: Καλπαξής, Δημήτριος
• Language: gr
• Published: 2011
• Subjects: Ριβοσώματα; Τελιθρομυκίνη; 615.792 2; Ribosomes; Telithromycin
• Online Access: http://nemertes.lis.upatras.gr/jspui/handle/10889/4573

Η πρωτεϊνική σύνθεση είναι ένας σημαντικός στόχος για τα αντιβιοτικά. Μεγάλη ποικιλία αντιβιοτικών αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των παθογόνων βακτηρίων, προσδενόμενα στα ριβοσώματά τους. Η τελιθρομυκίνη είναι ένα ημισυνθετικό παράγωγο της ερυθρομυκίνης, που ανήκει στην οικογένεια των κετολιδίων και επιδεικνύει αντιμικροβιακή δραστικότητα σε αρκετά βακτήρια που είναι ανθεκτικά στην ερυθρομυκίνη. Είναι ένας ισχυρός αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης, παρεμποδίζοντας τη διέλευση της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το κανάλι εξόδου. Για να αναλύσουμε την αλληλεπίδραση της τελιθρομυκίνης με το βακτηριακό ριβόσωμα, μελετήσαμε τη σύνδεση του αντιβιοτικού σε E.coli ριβοσώματα χρησιμοποιώντας κινητική συναγωνισμού πρόσδεσης. Συγκεκριμένα, η πρόσδεση της τελιθρομυκίνης μελετήθηκε σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου E.coli, όπου το εν λόγω αντιβιοτικό συναγωνίζεται την τυλοσίνη για κοινές θέσεις δέσμευσης επί του τριμερούς συμπλόκου C (AcPhe-tRNA•poly(U)•ριβόσωμα), ενός λειτουργικού αναλόγου του εναρκτήριου συμπλόκου. Η τυλοσίνη, ένα 16-μελές μακρολίδιο, αναστέλλει το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, ενώ η τελιθρομυκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Τα κινητικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι η τελιθρομυκίνη και το ριβοσωματικό σύμπλοκο C αλληλεπιδρά σε μοριακή αναλογία 1:1 για να σχηματίσει ταχέως ένα CT σύμπλοκο, το οποίο στη συνέχεια ισομεριώνεται βραδέως σε ένα σταθερότερο σύμπλοκο C*T. C+ T CT C*T Το πρώτο στάδιο της διαδικασίας δέσμευσης περιλαμβάνει μία σχετικά χαμηλής συγγένειας θέση δέσμευσης, που τοποθετείται στην είσοδο του καναλιού εξόδου της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (KT =500 nM). Το δεύτερο στάδιο αναπαριστά μία διαμορφωτική αλλαγή με σταθερά ισομερισμού (Κισομ.) ίση με 58,9 , η οποία ωθεί το αντιβιοτικό βαθύτερα στο εσωτερικό του τούνελ σε μία θέση υψηλής συγγένειας (KT*=8,13 nM). Μεταλλαγή του νουκλεοζίτη U754 σε αδενοσίνη μειώνει στο ήμισυ την ικανότητα μετατόπισης της τελιθρομυκίνης στην τελική της θέση (Κισομ.=25,7), μέσω λεπτών αλλαγών στις σταθερές ταχύτητας σχηματισμού και διάστασης του συμπλόκου C*T. Αντίθετα, η μεταλλαγή U2609C μειώνει 5-φορές τη μετακίνηση του αντιβιοτικού προς τη θέση υψηλής συγγένειας και αποσταθεροποιεί το σύμπλοκο C*T, προσδίδοντας στην Κισομ. τιμή ίση με 2,6. Δεδομένου ότι οι δύο νουκλεοζίτες έχουν εντοπιστεί με κρυσταλλογραφία στην ίδια περιοχή του καναλιού εξόδου, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την άποψη ότι μερικά ριβοσωματικά κατάλοιπα, αν και εντοπισμένα σε γειτονικές θέσεις, μπορεί να έχουν εντελώς διαφορετική συνεισφορά στην εγκατάσταση ενός φαρμάκου επί του ριβοσώματος. Μεταλλάξεις στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες L22 και L4 προκαλούν διαφορετικές μεταβολές στην πρόσδεση της τελιθρομυκίνης στο ριβοσωματικό σύμπλοκο C. Συγκεκριμένα, η αφαίρεση των αμινοξέων 82-84 στον εκτεταμένο βρόγχο της L22 μειώνει δραστικά τη σταθερά ισομερισμού (Κισομ.= 1,53), ενώ η μετάλλαξη Lys63Glu στην πρωτεΐνη L4 ασκεί μέτρια επίδραση στην ολική συγγένεια της τελιθρομυκίνης για το ριβοσωματικό σύμπλοκο C (KT*=12 nM). Και οι δύο μεταλλάξεις προκαλούν ισχυρή ανθεκτικότητα έναντι της ερυθρομυκίνης. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν σημαντική προσφορά στη χαρτογράφηση της θέσης πρόσδεσης της τελιθρομυκίνης στο προκαρυωτικό ριβόσωμα και επιβεβαιώνουν την υπεροχή της αντιμικροβιακής δράσης της τελιθρομυκίνης έναντι της ερυθρομυκίνης. === Protein synthesis is an important target for antibiotics. A wide range of antibiotics inhibit the growth of pathogenic bacteria, by binding to the ribosome. Telithromycin is a semisynthetic derivative of erythromycin, which belongs to the family of ketolides and causes increased antimicrobial activity in several bacteria that are resistant to erythromycin. It is a potent inhibitor of protein synthesis by preventing the passage of nascent polypeptide chain through the exit tunnel. To analyze the interaction of telithromycin with the bacterial ribosome, we examined the binding of the drug to E.coli ribosomes, using competitive kinetics. Namely, the binding of telithromycin was studied in a free-cell system derived from E.coli, where it competes with the antibiotic tylosin for common binding sites on the ternary complex C (AcPhe-tRNA • poly (U) • ribosome), an active analogue of the initiator complex in protein synthesis. Tylosin, a 16-member macrolide, inhibits peptide bond formation, while telithromycin fails to affect the activity of peptidyltransferase. The kinetic data suggest that telithromycin and the ribosomal complex C interact at a molecular ratio of 1:1 to form quickly a CT complex, which then slowly isomerized to a tighter complex C*T. C+ T CT C*T The first step of the binding procedure includes a relative low-affinity binding site, situated at the entrance of the exit tunnel of the large ribosomal subunit (KT = 500 nM). The second step represents a slow conformational change with an isomerization constant (Kisom.) equal to 58.9, which pushes the drug deeper into the tunnel, in a high-affinity site (KT*=8.13 nM). Mutation of nucleoside U754 to adenosine reduces moderately the ability of telithromycin to translocate to its final position (Kisom.=25.7), through minor effects on the forward and reverse rate constants of the isomerization step. In contrast, mutation U2609C reduces 5-fold the shift of the drug to the high-affinity site and also destabilizes the final complex C*T, leading to a value for Kisom. equal to 2.6. Taking into account, that both ribosomal nucleosides have been crystallographycally localized at the same region of the exit tunnel, our results emphasize the notion that some ribosomal residues, although placed at neighboring positions, may have entirely different contribution on the accommodation of a drug into the ribosome. Mutations in ribosomal proteins L4 and L22 affect diversely the binding of telithromycin to ribosomal complex C. Especially, removal of amino acids 82-84 in the extended loop of L22 significantly reduces the isomerization constant (Kisom. = 1.53), while mutation Lys63Glu in protein L4 exhibits a moderate effect on the overall affinity of telithromycin for the ribosomal complex C (KT *= 12 nM). Both mutations render E.coli resistant against erythromycin. Our results contribute significantly to the mapping of telithromycin binding site in prokaryotic ribosome and confirm the superiority of telithromycin as an antimicrobial agent, when compared with erythromycin.