Detecção e quantificação da expressão de genes de resistência aos azoles em Candida albicans

• Main Author: Ricardo, Elisabete Travassos Araújo
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Faculdade de Medicina da Universidade do Porto 2011
• Subjects: Medicina e Oncologia Molecular; Porto
• Online Access: http://hdl.handle.net/10216/22064

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular === Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine === 1. Resumo Diversos mecanismos moleculares estão associados a resistência a antifúngicos em fungos patogénicos mais propriamente, Candida albicans: sobre-expressão dos genes CDR1, CDR2 e MDR1 que codificam para bombas de efluxo; alterações no nível de expressão ou mutações pontuais no gene ERG11, que codifica para a proteína alvo dos antifúngicos azoles, lanosterol 14 -desmetilase, envolvida na via biossintetica do ergosterol. Com o presente trabalho pretendeu-se esclarecer o(s) mecanismo(s) de resistência associados a um grupo alargado de estirpes clínicas de C. albicans procedendo a estudos fenotípicos e de expressão génica. Foram utilizadas 5 estirpes controlo e 62 estirpes clínicas de C. albicans (isoladas de diferentes produtos biológicos). Procedeu-se à determinação do fenótipo das estirpes controlo e clínicas, através do protocolo padrão do CLSI M27-A2, estabelecendo-se a concentração inibitória mínima para os antifúngicos fluconazole, itraconazole e voriconazole, na presença e ausência do ibuprofeno (100µg/ml). Para além disto, foi testada a hipótese de reversão de resistência devido a efluxo, por citometria de fluxo, usando o marcador fluoresecente FUN-1, descrito como marcador de efluxo. Em seguida, procedeu-se à optimização dos protocolos para a detecção e quantificação da expressão dos genes alvo CDR1, CDR2, MDR1 e ERG11, por PCR em Tempo Real. Diferentes parâmetros de reacção foram ensaiados para obtenção de curvas padrão, com valores de eficiência e erro dentro dos limites de referência, para assegurar a fiabilidade dos ensaios realizados. O gene ACT1 que codifica para a actina foi usado como gene normalizador dos níveis de expressão. A maioria das estirpes clínicas de C. albicans, resistentes a múltiplos azoles apresentaram uma sobre-expressão significativa dos genes CDR1 e principalmente CDR2, quando comparados com o gene ERG11; nestas o ibuprofeno induziu a reversão de resistência, aumentando a coloração pelo FUN-1. Nas 2 estirpes em que não ocorreu reversão do fenótipo resistente, o ibuprofeno não aumentou a fluorescência das células marcadas com FUN-1; para além disso, o aumento da expressão dos genes não se limitou ao CDR1 e CDR2 mas foi também significativa para o gene ERG11. De referir que a estirpe controlo 12-99 com múltiplos mecanismos de resistência descritos, não reverteu o seu fenótipo resistente na presença do ibuprofeno. Não foi detectada expressão do gene MDR1 em qualquer uma das estirpes clínicas resistentes. Estirpes com múltiplos mecanismos de resistência não reverteram pelo que o ibuprofeno parece ser um potencial bloqueador de efluxo de antifúngicos. A técnica de PCR em Tempo Real é um método prático e sensível em estudos de expressão génica, assim como o uso de SYBR Green é fiável, apesar de ser um marcador inespecífico, quando se insere em cada ensaio uma curva de fusão. === 2. Abstract Several resistance mechanisms are associated to antifungal resistance in pathogenic fungi, namely C. albicans: over-expression of CDR1, CDR2 and MDR1 genes encoding for eflux pumps; alterations in gene expression levels or point mutations in ERG11 gene, encoding for the azoles target enzyme lanosterol 14 - demethylase, associated to ergosterol biosynthesis. The aim of the present work was to uncover the resistance mechanisms in a large group of clinical C. albicans strains, performing phenotypic and gene expression studies. Five control strains and 62 clinical strains of C. albicans were used. Standard protocol from CLSI M27-A2 was used to determine the susceptibility phenotype calculating minimal inhibitory concentration for the antifungals fluconazole, itraconazole and voriconazole, with and without ibuprofen (100µg/ml). Also, reversion by efflux hypothesis was tested by flow cytometry, using as fluorescent marker FUN-1, known as an efflux marker. Next, real time PCR protocols for detection and quantification of the target genes CDR1, CDR2, MDR1 e ERG11, were optimized. Different reaction parameters were tested, to achieve values of efficiency and error obtained from standard curves, according to reference values, to ensure accuracy. ACT1 gene, which encodes for actin was used as normalizing gene for the gene expression levels. Most clinical strains resistant to all tested azoles showed a significant over-expression of CDR1 and specially CDR2 when compared to ERG11; in these strains ibuprofen induced the reversion of resistance and an increase in FUN-1 fluorescence. The 2 strains that did not revert their phenotype, ibuprofen did not increase the fluorescence of cells stained with FUN-1 and gene over-expression was not only for CDR1 and CDR2 but mostly for ERG11 gene. It should be stressed that C. albicans control strain 12-99 with known multiple resistance mechanisms did not revert the resistance phenotype in the presence of ibuprofen. MDR1 expression was not detected in none of the C. albicans clinical strains. Strains with multiple resistance mechanisms did not revert, wich might indicate that ibuprofen could be a potential antifungal efflux blocker. Real Time PCR is easily available and a sensitive method for gene expression studies, and also SYBR Green is acceptable, although being an unspecific marker, when a melting curve is added in each assay.