| Summary: | O cancro gástrico (CG) é a sexta neoplasia mais frequente em todo o mundo comuma estimativa de quase um milhão de novos casos em 2012. Além disso, representa a 3ªmaior causa de morte por cancro. GC é usualmente classificado de acordo com as suascaracterísticas histológicas utilizando o sistema de classificação proposto por Lauren ecolegas ou a classificação recomendada pela OMS. No entanto, esses sistemas declassificação apresentam uma utilidade clínica reduzida, especialmente na monitorização eescolha do tratamento. Apesar da infecção por Helicobacter pylori e dieta serem osfactores etiológicos mais frequentemente associados ao CG, a infeção por EBV tem sidodetectada em diferentes subtipos histopatológicos. De facto, os carcinomas gástricosassociados ao EBV (EBVaGC) representam cerca de 10% de todos os carcinomasgástricos. A comunidade científica têm vindo a debater o papel da infeção pelo EBV nocarcinoma gástrico, e estudos recentes sugerem que EBVaGC representa um subgrupodistinto com características moleculares específicas.Os principais objetivos deste estudo foram: 1) caracterizar a infecção por EBV emcarcinomas gástricos e displasia gástrica; 2) investigar as características moleculares doscancros gástricos associados a EBV, incluindo a instabilidade microssatélites (MSI) e aexpressão e presença de mutações do gene da p53; 3) investigar o papel do EBV nacarcinogénese gástrica, especialmente na desregulação da proteína p53.Para atingir todos esses objetivos, este estudo incluiu três grupos diferentes: 179doentes consecutivos com CG, 17 carcinomas gástricos com estroma linfoide (GCLS) e199 doentes consecutivos com displasia gástrica ou carcinoma gástrico superficial. Apresença do EBV foi detectada em todos os tumores e lesões por hibridação in situ.Os resultados revelaram que os carcinomas gástricos associados ao EBVrepresentam 8,4% (15/179) de todos os casos de CG e que a distribuição do EBV variasignificativamente entre grupos histológicos. A análise estatística demonstrou que oscarcinomas EBV-associados são mais frequentes no terço superior e na região central doestômago, e revelou também que esses doentes apresentam menor envolvimento degânglios linfáticos regionais e uma tendência para um melhor prognóstico.Como esperado, 82,2% (15/17) de todos os GCLS mostraram estar associadas aoEBV. Em contraste, o EBV mostrou estar ausente em todos os casos de lesões gástricassuperficiais, sugerindo que EBV é um evento tardio no processo de carcinogénese gástrica.A instabilidade de microssatélites foi avaliada por imuno-histoquímica (IHQ) emtodos os casos positivos para o EBV e os resultados revelaram que apenas 3,7%apresentavam altos níveis de instabilidade. As mutações no gene TP53 foram investigadaspor sequenciação, e os níveis de proteínas e mRNA foram avaliados por IHQ e RT-qPCR,respetivamente. Os resultados demonstraram que os carcinomas gástricos associados aoEBV raramente apresentam mutações no gene da p53 e que se caracterizam por baixosníveis de RNA mensageiro e uma sobre-expressão da proteína p53. Com base nestesresultados, conclui-se que o EBV parece induzir a estabilização da p53 por meio das suasoncoproteínas.Uma revisão sistemática foi realizada para resumir todos os dados publicados sobrea expressão das proteínas do EBV em tumores gástricos e determinar o perfil de latênciaassociado a essas neoplasias.A revisão mostrou que o EBV exibe um padrão de transcrição distinto, que não seenquadra em nenhum dos padrões de latência do EBV já descritos. Esse padrão écaracterizado pela expressão dos EBERS, EBNA1 e LMP2A (em 53% dos casos). Combase nesses resultados, um estudo in vitro foi desenvolvido para estudar o efeito da infeçãopor EBV (e dos seus transcritos: EBNA1, da origem de replicação do EBV e dos BARTmicroRNAs) nos níveis de p53 em células gástricas. Tal como observado nos tumoresEBV-positivos, verificou-se que o EBV causa uma sobre-expressão de p53 e umadiminuição nos níveis de mRNA. Além disso, este estudo também sugere que a EBNA1 ea origem de replicação do EBV podem contribuir para a estabilização p53.Este estudo contribui para o conhecimento do papel do EBV no desenvolvimentodo cancro gástrico. Confirma a associação do EBV com um grupo específico de CG emPortugal e descreve as suas características clinicopatológicas, que podem ser exploradaspara desenvolvimento de novas estratégias de monitorização e tratamento destes doentes. === Gastric cancer (GC) is the fifth most common malignancy worldwide with nearlyone million new cases estimated in 2012 and remains the 3th leading cause of death bycancer. Actually, GC is divided according to histologic characteristics using the Lauren orWHO classifications but these systems have a reduced clinical utility in patient monitoringor therapy selection. Epstein-Barr Virus (EBV) has been detected in differenthistopathological subtypes of gastric carcinoma and EBV-associated gastric carcinoma(EBVaGC) has been recently recognized as new subtype of GC with specific molecularfeatures. Scientific community is still debating the role of EBV infection on gastriccarcinogenesis as well as its clinical utility.The principal aims of this study were: 1) to characterize of EBV infection in both,gastric dysplasia and gastric carcinomas; 2) to investigate molecular features of EBVassociatedgastric cancers, including microsatellite instability (MSI), expression andmutations of TP53 gene; 3) to investigate the role of EBV in gastric carcinogenesis,especially in p53 de-regulation.Three distinct groups of patients were included in this thesis: 179 consecutivepatients with GC, 17 gastric carcinomas with lymphoid stroma (GCLS), and 199consecutive patients with gastric dysplasia or superficial gastric carcinoma.EBV infection was detected in all tumours/lesions by in situ hybridization. Theresults revealed that EBVaGC represents 8.4% (15/179) of all GC cases, with a significantdifferential distribution among histological types. The analysis revealed a higherpredominance of EBVaGC in the upper third and middle of the stomach, a significantlower number of regional lymph nodes invasion and a tendency for better prognosis. Asexpected, 82.2% (15/17) of all GCLS showed to be EBV-associated. In contrast, theanalysis of EBV in superficial gastric lesions revealed that EBV was not detected inepithelial cells of any case with dysplasia or superficial carcinomas. These results stronglysuggest that EBV is a late event of gastric carcinogenesisThe MSI status was evaluated by immunohistochemistry (IHC) in all EBVaGC andthe results revealed that only one case (1/27, 3.7%) presented high levels of MSI. The roleof p53 in EBVaGC was studied by detecting its expression using IHC, and the TP53mRNA levels using RT-qPCR. TP53 mutations were also investigated by sequencing. Theresults revealed that EBVaGC are characterized by a significant decrease of TP53 mRNAlevels with a strong p53 expression and rare TP53 mutations (only one mutation withunknown significance was detected among EBVaGC cases) when compared with EBVnegative cancers. These results show that EBV seems to induce a stabilization of p53 inEBVaGC independently of the presence of mutations.Considering that EBV has distinct expression pattern, we decided to perform asystematic-review to summarize the evidences regarding the EBV proteins expression ingastric tumours that could provide clues to the molecular features of EBVaGC. Thesystematic-review revealed that EBVaGC is characterised by the expression of EBERS,EBNA1, and LMP2A (in 53% of cases), a unique transcription pattern that does not fit the'standard' EBV latency patterns.Finally, we have developed an in vitro study to study the effect of EBNA1, EBVoriP, and BART microRNAs on p53 levels and also to test whether EBV can affect p53function in gastric cells. Data confirmed that EBV causes an overexpression of p53accompanied by a decrease of mRNA levels and that the explanation for these is lined toEBNA1 and EBV oriP activity. These results are important contributions for the EBVaGCcarcinogenesis knowledge.Our data extend the understanding of the link between EBV and gastric carcinomasin Portugal and also contribute to the knowledge of viral carcinogenesis. This researchconfirms that EBV is a late event of GC but with an active role on GC development; andthat EBVaGC is a distinct subtype of GC with specific clinicopathological features thatshould be further explored to develop new strategies of management and treatment.
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