Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren

• Main Author: Hellmann, Tina Verena
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2013
• Subjects: Knochen-Morphogenese-Proteine; Rezeptor; Transforming Growth Factor; ddc:570
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/7325; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/7325/Dissertation_Tina_Verena_Hellmann.pdf

Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die größte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schlüsselfunktionen während der frühen Embryogenese inne und regulieren darüber hinaus die Organogenese sowie die Homöostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale über zwei Typen transmembranärer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur fünf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegenüber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuität der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden können, müssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. Kürzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben – die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. Für das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abhängige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widersprüchlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zunächst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies ermöglichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodomänen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberflächen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten darüber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodomänen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der lösliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabhängig inhibiert, während die membranverankerte RGMb-Variante eine Verstärkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodomänen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivität neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich für die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodomäne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere Überlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren für die Ausbildung der beobachteten Selektivität verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellulärer Ebene analysieren zu können, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte für BMP-Rezeptoren sowie für RGMb synthetisiert und ein funktionelles Färbeprotokoll für die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit präsentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt für die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Darüber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, möglicherweise völlig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifität und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden könnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge für eine zukünftige detaillierte Aufklärung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abhängigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellulärer Ebene dar. === Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) comprise the largest subgroup of the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) superfamily of secreted growth factors. They are key regulators of early embryogenesis and orchestrate the development as well as the homeostasis of several tissues and organs in adult organisms. BMPs transduce their signals through two types of transmembrane serine/threonine kinase receptors termed type I and type II receptors. An imbalance in BMP-ligand and receptor numbers - about twenty different BMP-ligands face only five type I and three type II receptors - causes a pronounced promiscuity in ligand/receptor interactions. Therefore, a complex regulatory network is necessary to enable specific signaling of each BMP ligand despite a temperospatial expression overlap. Most of the discovered regulatory processes inhibit BMP-signal transduction. Recently, the first membrane-associated BMP-specific agonists - the Repulsive Guidance Molecule (RGM) family of coreceptors comprised of RGMa, RGMb and RGMc - have been discovered. Aside from stimulatory effects, evidence for a potential inhibitory activity of the RGM family member RGMb on BMP-induced signal transduction has previously been described. To clarify these contradictory RGMb functions, extensive biochemical and biophysical characterizations were carried out. In the course of this work, an efficient expression and purification strategy was established resulting in great yields of highly pure recombinant RGMb coreceptor protein. Subsequent in vitro binding assays based on surface plasmon resonance (SPR) showed that RGMb specifically interacts with BMP ligands, while no binding to other subfamily members could be detected. Contradicting published data, no direct interactions of the RGMb coreceptor with type I and type II receptor ectodomains were determined. Furthermore, cell-based competition assays revealed that soluble RGMb protein lacking the glycosylphosphatidylinositol anchor dose-dependently inhibits BMP-induced signal transduction. Characterizing the influence of the membrane anchored RGMb coreceptor on BMP signaling pointed to a more complex situation. Hence, only minor deviations of the BMP-dependent signal transduction in RGMb-transfected compared to control cells could be detected. These differences could possibly indicate a sensitizing activity of the RGMb coreceptor on BMP-signaling as it has been described before. SPR-based co-injection experiments revealed that BMP ligands bound to RGMb lose their ability to interact with type I receptor ectodomains. Thus, the coreceptor blocks the type I receptor binding epitope, thereby neutralizing the signaling activity of BMP ligands. However, comparative experiments using BMP variants pointed out that the coreceptor/ligand interface involves other binding hot spot residues than the type I receptor/ligand interaction. Analyzing the influence of RGMb on the BMP/type II receptor interaction based on SPR measurements led to a different outcome: In the presence of the RGMb coreceptor, BMP ligands were solely able to interact with the extracellular domain of the type II receptor ActR IIB, while no binding could be detected with neither ActR II nor BMPR II ectodomains. Hence, binding of the coreceptor does not directly interfere with the BMP ligand/type II receptor core interface, whereas a partial peripheral overlap of RGMb with the type II receptor epitope may evoke the observed selectivity for ActR IIB. In order to clarify the observed interactions in the cellular context, RGMb and BMP receptor fusion constructs based on the SNAP-/CLIP-tag® technology as well as efficient labeling protocols and confocal microscopic procedures were established. The biochemical characterization of RGMb along with the extensive interaction studies of this coreceptor with a multiplicity of BMP-ligands and their receptors presented in this work, narrow down the location of the RGMb binding epitope, thus providing an ideal starting point for the subsequent determination of the coreceptor binding domain by site directed mutagenesis. Moreover, the presented in vitro binding studies point to a more complex and possibly novel regulatory mechanism of the BMP signal transduction by RGMb than previously assumed. Thus, the presence of the coreceptor selectively regulates the type II receptor specificity and potentially also the recruitment of BMP-ligands into certain membrane compartments (e.g. lipid raft-domains), herewith fine-tuning BMP-induced signals. The SNAP- and CLIP tag® fusion constructs produced in this work together with the established protocols for confocal microscopy analyses provide efficient tools for subsequent extensive examinations of theses regulatory processes in living cells (e.g. by FRET measurements).