Klonierung und Sequenzierung der zur Lipopolysaccharid-Biosynthese notwendigen Gene von Legionella pneumophila Serogruppe 1

• Main Author: Metter, Nicole
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2003
• Subjects: ddc:610
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/553; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6500; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6500; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/553/Legionella_pneumophila_Nicole_Metter.pdf

Durch den monoklonalen Antikörper mAk 2625, der ein Epitop im Bereich des LPS bindet, konnte für den virulenten Stamm RC1 von Legionella pneumophila Serogruppe 1 Subgruppe OLDA eine spontane instabile LPS-Mutante isoliert werden. Die Mutante zeigte eine Phasenvariation des Epitops, sowie einen Verlust der Virulenz und Serumresistenz. Um Zugang zum molekularen Mechanismus der Phasenvariation des LPS zu bekommen, erfolgte zunächst die Komplementierung der stabilen mAk 2625-negativen LPS-Mutante 137 mit der Genbank des zugehörigen Wildtyps. Die Komplementierung und Rekonstitution des mAk 2625-Epitops gelang mit einem 3 kb langen klonierten genomischen Fragment. Die Mutation des Stammes 137 konnte einer Deletion eines Cytosin-Restes im später benannten Orf 8 zugeschrieben werden. Das Protein welches sich aus der Sequenz von Orf 8 ableitet, zeigt Homologien zu bakteriellen Methyltransferasen. Mit Sonden, welche sich aus den klonierten Fragmenten ableiteten, konnte eine Genbank des Stammes RC1 nach LPS-Biosynthese-Genen durchsucht werden. Auf diese Weise gelang die Identifizierung einer 32661 bp langen Region des Genoms von Legionella pneumophila, die 30 mögliche offenen Leseraster (Orfs) enthält. Einige dieser Orfs zeigen signifikante Homologien zu bekannten Gensequenzen der Core- und O-Antigen-Biosynthese. Der molekulare Mechanismus der Phasenvariation konnte jedoch durch diese Untersuchungen nicht entschlüsselt werden. Erst anschließende Untersuchungen zeigten, daß es sich um ein 30 kb langes instabiles genetisches Element handelt, das vermutlich auf einen Phagenursprung zurückgeht. === By the aid of the monoclonal antibody mAb 2625, recognizing an LPS-epitope, a spontaneous instable mutant could be isolated for the virulent strain RC1 of Legionella pneumophila serogroup 1 subgroup OLDA. The mutant showed phase variation of the epitope as well as loss of virulence and serum resistance. To get access to the molecular mechanism of the phase variation, first a stable mAb 2625-negative mutant called 137 was complemented by a genomic library from the corresponding wildtype strain. The complementation and reconstitution of the mAb 2625-epitope was possible by a cloned genomic fragment of 3 kb length. The mutation of strain 137 could be assigned to a deletion of a cytosine residue in the later named Orf 8. The protein encoded by Orf 8 exhibited homology to bacterial methyl-transferases. With probes deriving from the cloned fragments, a genomic library of the strain RC1 could be screened for genes of the lipopolysaccharide biosynthesis. By this strategy the identification of a 32661 bp region comprising 30 putative open reading frames of Legionella pneumophila was possible. Some of these Orfs showed significant homologies to known gene sequences involved in the core and O-antigen biosynthesis. The molecular mechanism of the phase variation could not be revealed through these investigations. Following studies showed a 30 kb instable genetic element of presumable phage origin to be responsible for the phase variation.