Stabilität der epitheliotrophen Potenz von Serum vor und nach Kryokonservierung

• Main Author: Fischer, Kai Reiner
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2011
• Subjects: Augentropfen; Serum; Keratokonjunktivitis sicca; ddc:610
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/4599; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54104; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54104; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/4599/FischerKRDiss.pdf

Einleitung Augentropfen aus autologem Serum (AT) werden seit ca. zehn Jahren erfolgreich in der Therapie von Erkrankungen des äußeren Auges eingesetzt [Yamada et al. 2008]. Die relativ aufwendige individuelle Herstellung sowie die derzeitigen gesetzlichen Regularien schränken bisher die flächendeckende Versorgung der Patienten mit AT ein. Der Nachweis der Funktionalität der AT nach einer verlängerten Haltbarkeit von sieben Tagen bei +4°C bzw. sechs Monaten Lagerungen bei -20°C könnte die Logistik vereinfachen und somit die Versorgungssituation der Patienten verbessern. In dieser Studie wurde die Stabilität verschiedener Inhaltsstoffe und des wundheilungsfördernden Einflusses von AT in verschiedenen Verdünnungsstufen unter verschiedenen Lagerungsbedingungen untersucht. Materialien und Methodik Nach Vorliegen des Votums der Ethikkommission der Universität Würzburg wurde von zehn gesunden Männern 300 ml Vollblut in sterilen Serummonovetten abgenommen. Die Präparation erfolgte entsprechend dem Protokoll von Liu et al. [2005]. Die AT wurden unverdünnt (AT100), bzw. mit Balanced Saltsolution (BSS) für die Ophthalmologie auf 50% (AT50) oder 20% (AT20) verdünnt und bei 6° für 7 Tage bzw. bei -20° für 3 und 6 Monate gelagert. Die Untersuchung der Proben erfolgte am Tag der Entnahme, nach 7 Tagen, 3 Monaten und 6 Monaten. Die Konzentration von Epidermalem Wachstumsfakor (EGF), Fibronektin, Vitamin A und E, IgA und Albumin wurden mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Photometrie oder Turbidimetrie gemessen. Für den Nachweis der Funktionalität der AT in vitro wurden immortalisierte Hornhautepithelzellen (HCE-Zellen) verwendet. Folgende Parameter wurden untersucht: Proliferation mit Hilfe eines lumineszensbasierten ATP-Assays, Migration im Kolonie-Dispersions-Assay und Wundheilungspotenz mittels Scratch-Wound-Assay. Ergebnisse Die untersuchten laborchemischen Parameter zeigten während der Lagerung nur geringe Schwankungen und keinen signifikanten Unterschied zwischen den frischen, den sieben Tage und den sechs Monate gelagerten Proben. Mit dem Kolonie-Dispersions-Assay wurde die Migrationsfähigkeit der HCE-Zellen über max. 144 h erfasst. Zu jedem Messpunkt und bei jeder Konzentration war eine Zunahme des Durchmessers der Zellrasen zu beobachten, außer für sechs Monate gelagerte AT20. Die stärkste Dispersionstendenz zeigte die Zellen für AT100. Auch für den Scratch-Wound-Assay und ATP-Assay konnte keine signifikante Änderung zum frischen Ausgangsmaterial gezeigt werden. Konklusion 1. Die Konzentration der untersuchten Inhaltsstoffe und der wundheilungsfördernde Einfluss von AT ist nach sieben Tagen bei +4°C bzw. nach sechs Monaten Lagerung bei -20°C nicht signifikant verändert. 2. Es konnte kein eindeutiger Parameter für die Kontrolle der AT gefunden werden. Aufgrund der Bedeutung für die Augenoberfläche und aufgrund der einfachen Nachweismethode bietet sich die Überwachung von Albumin oder Vitamin A & E an. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die verwendete Verdünnung ebenfalls keinen Einfluss auf die Lagerfähigkeit hat. 3. Weitere Studien über andere trophische Faktoren oder über einen Zeitraum bis zu 12 Monaten sollten folgen. Auch die klinische Überprüfung der gefundenen Ergebnisse steht aus. === Purpose: Serum eye drops are used for the treatment of ocular surface disease (e.g. Sicca Syndrome). The objective of this study was to investigate whether they maintain their wound healing potency after a prolonged storage of six months at -20°C and was to find a parameter which can serve as a quality and stability indicator. Design: experimental study Methods: After obtaining whole blood from 10 volunteers and preparation of 100% (AS100), 50% (AS50), 20% (AS20) serum eye drops, epitheliotrophic factors including EGF, fibronectin, vitamin A & E, albumin and IgA were quantified before and after storage for 7 days at 6°C or 3 and 6 months at -20°C. Human corneal epithelial cell (HCE) line were used to investigate proliferation, migration and overall wound healing potency of the cells in response to different serum preparations. Main Outcome Measures: The proliferation, migration and wound healing of HCE were measured after incubation with different serum eye drop concentrations and after different storage conditions. Results: The concentration of EGF, fibronectin, vitamins A & E, IgA and albumin showed no significant reduction over the test period. Proliferation, migration and wound healing of HCE cells was significantly better after incubation with undiluted serum in comparison with diluted serum. No significant loss of cytokine concentration, wound healing and proliferation effect in HCE culture of AS100, AS50 and AS20 could be detected over the 6 months of storage. Conclusion: The concentration of a spectrum of cytokines involved in corneal epithelial wound healing and the epitheliothrophic effect of serum are not significantly changed after a prolonged storage of six months at -20°C. Hence it seems justifiable to provide patients with appropriate freezer capacity with a 6 months supply of autologous serum eye drops. Among the many parameters tested albumin may be due to cost effectiveness and its importance for the ocular surface an appropriate parameter to serve for stability controls.