Expressionsanalytische und behaviourale Phänotypisierung der Nos1 Knockdown Maus

• Main Author: Kittel-Schneider, Sarah
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2010
• Subjects: Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom; Stickstoffoxidsynthase; Dopaminstoffwechsel; Serotonin; Stickstoffmonoxid; Stickstoffmonoxid-Synthase; Arbeitsg; ddc:610
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/4415; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52689; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52689; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/4415/Doktorarbeit_KittelSchneider_final_11.pdf

Der gasförmige Neurotransmitter Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine Rolle bei verschiedenen physiologischen Vorgängen, aber auch psychiatrischen Erkrankungen wie Aggression, Ängstlichkeit, Depression und auch bei kognitiven Funktionen. Um mehr über die physiologische Rolle von NO herauszufinden untersuchten wir mittels Gen-Expressionsanalyse und Verhaltensversuchen Mäuse, bei denen die neuronale Isoform der Stickstoffmonoxidsynthase ausgeschaltet wurde. Die so genannte NOS-I ist die hauptsächliche Quelle von NO im zentralen Nervensystem. Knockout Tiere sind wertvolle Werkzeuge um sowohl den Einfluss eines Gens auf Verhalten als auch möglicherweise damit zusammenhängende Veränderungen des Transkriptoms zu identifizieren. Dies ist wichtig um herauszufinden, mit welchen molekularen Pfaden bestimmte Verhaltensweisen korreliert sind. In Bezug auf NOS-I gibt es zwei bisher beschriebene Knockout Mäuse Stämme. Es existieren KOex6 Knockout Mäuse, in welchen es überhaupt keine katalytisch aktive NOS-I gibt und es gibt einen Mausstamm, bei dem Exon 1 deletiert wurde, was aufgrund alternativer NOS-I Splicevarianten zu einer residualen Expression von bis zu 7% führt. Daher sind diese Mäsue besser zutreffend als Knockdown Mäuse zu bezeichnen. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Nos1 Knockdown Mäuse, da die hier vorliegende Situation wohl ähnlicher zu der bei menschlicher genetischer Varianten ist, da eine komplette Disruption bisher noch nicht beim Menschen beschrieben wurde. Es gibt diverse Studien, welche den behaviouralen Phänotyp der Nos1 Knockdown Mäuse untersuchen, aber diese widersprechen sich zum Teil. Bei unserer Untersuchung legten wir den Schwerpunkt auf Verhaltenstests, welche spezifische Symptome des Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) aufdecken sollten. Wir führten den Elevated Plus Maze Test (EPM) und ein modifiziertes Lochbrett-Paradigma, die COGITAT-Box, durch. Um die den gefundenen Verhaltensänderungen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen herauszufinden, suchten wir nach Unterschieden der Expression des Serotonin- (5HTT) und des Dopamintransporters (DAT) zwischen den Knockdown und den Wildtyp Mäusen. Wir hatten spekuliert, dass die Disruption der NOS-I zu einer modifizierten Expression des DAT oder des 5HTT geführt habe könnte wegen den bekannten engen Interaktionen zwischen dem nitrinergen und den monoaminergen Systemen. Wir fanden einen diskret anxiolytischen Phänotyp, da die Knockdown Mäuse eine längere Zeit auf dem offenen Arm des EPM verbrachten bzw. häufiger den offenen Arm betraten im Vergleich zu dem Wildtypen. Dies war nicht durch eine höhere lokomotorische Aktivität zu erklären. Auch beobachteten wir ein geschlechterunabhängiges kognitives Defizit im Arbeits- und Referenzgedächtnis in der COGITAT-Box. Überraschenderweise fanden wir keine signifikante Dysregulation der Monoamin-Transporter in der Expressionsanalyse mittels der quantitativen Real Time PCR. Dies war eher unerwartet, da vorherige Studien verschiedene Veränderungen im serotonergen und dopaminergen System bei den Nos1 Knockdown Mäusen gefunden hatten, wie z.B. einen verminderten Serotonin-Umsatz in frontalen Cortex und hypofunktionale 5 HT1A and 5HT1B Rezeptoren. Auch ist bekannt, dass NO direkt Monoamin-Transporter nitrosyliert. Zusammenfassend zeigen die Nos1 Knockdown Mäuse ein charakteristisches behaviourales Profil mit reduzierter Ängstlichkeit und Defiziten im Gedächtnis. Weitere Studien sollten folgen um zu klären, ob diese Mäuse als Tiermodell für z.B. die Alzheimer-Erkrankung oder das Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndrom dienen könnten und die weitere pathophysiologische Rolle des NO bei neuropsychiatrischen Erkrankungen herauszufinden. === The gaseous messenger nitric oxide (NO) has been implicated in a wide range of behaviours, including aggression, anxiety, depression and cognitive functioning. To further elucidate the physiological role of NO and its down-stream mechanisms, we conducted behavioral and expressional phenotyping of mice lacking the neuronal isoform of nitric oxide synthase (NOS1), the major source of NO in the central nervous system. Knockout animals are valuable tools to identify both the behavioural impact of a given gene, as well as subsequent changes of the transcriptome to correlate behaviour to molecular pathways. With respect to NOS-I, two genetically modified mouse strains have been described in the literature. There are the KOex6 knockout mice in which you find a complete absence of catalytically active NOS-I and previously generated animals with a targeted deletion of exon 1 which show a residual NOS-I expression up to 7% rendering those mice actually Nos1 knockdown animals. In this study we used the knockdown animals because this situation seems to be more closely to human genetic variation, since a complete disruption of the gene has not yet been described in man. There a several studies on the behavioural phenotype of these animals but they are in part contradictory. In our investigations we had a special emphasis on ADHD-relevant tests, we performed the Elevated Plus Maze and a modified holeboard paradigm, the COGITAT Box. To further examine the underlying molecular mechanisms, we searched for differences in the expression of the serotonine and the dopamine transporter between the knockdown and the wildtype mice because we had speculated that disruption of the NOS-I might lead to a modified expression of the DAT or the 5HTT because of the tight interactions of NO and both the serotonergic as well as the dopaminergic system. A subtle anxiolytic phenotype was observed, with knockdown mice displaying a higher open arm time in the Elevated Plus Maze (student's t-test p>0.05) as compared to their respective wildtypes which was not caused by a higher locomotor acivity. Also there was gender-independent cognitive impairment in spatial learning and memory, as assessed by an automatized holeboard paradigm, the COGITAT Box. Here the working memory error and the reference memory error were in parts significantly different between knockdown animals and their respective wildtypes. Surprisingly no significant dysregulation of monoamine transporters was evidenced by qRT PCR. This we did not expect because of previous findings in Nos1 knockout mice that showed for example a reduced 5 HT turnover in the frontal cortex along with a concomitant increase in frontal 5-HT as well as 5 HT1A and 5HT1B receptor hypofunctioning and the fact that NO directly nitrosylates monoamine transporters. Taken together, Nos1 knockdown mice display a characteristic behavioural profile consisting of reduced anxiety and impaired learning and memory. Further research has to assess the value of these mice as animal models e.g. for Alzheimer’s disease or attention deficit disorder, in order to clarify a possible pathophysiological role of NO therein.