Wirtsspezifität der Gattung Legionella und Etablierung von Dictyostelium discoideum als Wirtsmodell

• Main Author: Hägele, Sonja
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2002
• Subjects: Legionella; Dictyostelium discoideum; Wirtsspezifität; Phagosom; ddc:570
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/351; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4256; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4256; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Abkuerzungen.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Diskussion.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Einleitung.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Ergebnisse.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Inhaltsverzeichnis.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Literaturverzeichnis.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Material-Methoden.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Titel.pdf; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/351/Zusammenfassung.pdf

Bei der Gattung Legionella handelt es sich um aquatische Stäbchenbakterien, die sich intrazellulär in verschiedenen Protozoen vermehren können. Neben der Nutzung des Protozoenwirtes können humanpathogene Legionella-Spezies in den Alveolarmakrophagen des menschlichen Respirationstraktes replizieren. Diese Besiedelung der Lunge kann zu einer atypischen Pneumonie, der Legionärskrankheit, führen. Humanpathogene Vertreter der Gattung Legionella weisen somit ein duales Wirtssystem auf. Die Wirtsspezifität phylogenetisch verschiedener Legionella Spezies wurde bislang nicht systematisch analysiert. Mit Hilfe von Infektionsversuchen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass für unterschiedlichste Legionella Spezies Acanthamoeba castellanii ein gut geeigneter Wirt darstellt. Hartmannella vermiformis und Naegleria gruberi ermöglichen dagegen nur einem eingeschränkten Legionella-Spektrum ein intrazelluläres Wachstum. Die jeweils höchsten Vermehrungsraten zeigten dabei in allen Amöben die Umweltisolate LLAP 10 und L. lytica sowie der humanpathogene Stamm L. pneumophila Corby. Außerdem scheint die Virulenz humanpathogener Legionellen-Spezies korreliert zu sein mit der Nutzung eines breiten Wirtsspektrums. Ciliaten wie Tetrahymena pyriformis sind im Gegensatz zu den Amöben als Wirte nicht so gut geeignet. Im Vergleich zu den Amöben ist sowohl die Anzahl der sich intrazellulär in T. pyriformis replizierenden Legionella-Spezies sowie deren Replikationsrate erniedrigt. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es Dictyostelium discoideum als neues Wirtsmodell zu etablieren. Bei dieser gut erforschten Bodenamöbe stehen zahlreiche molekularbiologische Methoden für das Manipulieren des Genoms zur Verfügung. Somit ist es möglich, die während einer Infektion benötigten Wirtsfaktoren von Seiten der Amöbe näher zu untersuchen. Mittels Infektionsversuchen sowie fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Methoden konnte die intrazelluläre Replikation von LLAP 10, L. lytica und L. pneumophila in D. discoideum gezeigt werden. Für L. pneumophila konnte durch FACS-Analyse festgestellt werden, dass Bakterien dieser Legionella-Spezies genauso wie in den bisher untersuchten Wirtszellesystemen zu Beginn der Infektion in einem nicht angesäuerten Kompartiment vorliegen. Für alle weiteren verwendeten Legionella Spezies sowie hitzeabgetötete L. pneumophila und die Futterbakterien Klebsiella aerogenes konnte dagegen eine Ansäuerung des Phagosoms nachgewiesen werden. Kolokalisierungsstudien des lysosomalen Markers DdLIMP mit Legionellen bestätigte außerdem eine Inhibierung der Phagolysosomfusion bei L. pneumophila, nicht jedoch bei der sich nicht replizierenden Spezies L. hackeliae. Die Untersuchung einer spezifischen Profilin-minus Dictyostelium-Mutante offenbarte eine erhöhte Phagozytoserate von Legionellen durch die Wirtszellen. Daraus resultierte auch eine leicht gesteigerte intrazelluläre Vermehrungsrate dieser Bakterien. Profilin ist ein Aktin-bindendes Protein und an der Regulation von Aufnahmeprozessen beteiligt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung Bakterien-haltiger Phagosomen aus D. discoideum etabliert. Die magnetische Reinigung von Phagosomen über paramagnetische, Bakterien-konjugierte Beads erwies sich als nicht praktikabel. Die daraufhin entwickelte Anreicherung der Phagosomen über Dichtegradienten-Zentrifugation erforderte jedoch zusätzlich die Eliminierung kontaminierender Lysosomen und Mitochondrien. Die Analyse des phagosomalen Proteoms erfolgte mittels Messung von Enzymaktivitäten und Western-Blotting-Experimenten. Dabei konnten keine quantitativen Unterschiede typischer lysosomaler Marker zwischen gereiften und ungereiften Phagosomen mit lebenden bzw. toten L. pneumophila detektiert werden. Ebenso verlief der Vergleich von ungereiften LLAP 10-haltigen Phagosomen und gereiften Klebsiella-haltigen Phagosomen. Dagegen zeigte die 2D-Gelelektrophorese des phagosomalen Proteoms vier Proteine, die in Phagosomen mit toten L. pneumophila Corby stärker exprimiert waren als in Phagosomen mit lebenden Legionellen. Weiterhin wurde ein Protein detektiert, das für Phagosomen, die lebende L. pneumophila Bakterien beinhalten, spezifisch ist. Dabei könnte es sich um einen von L. pneumophila zur Replikationsvakuole rekrutierten Wirtsfaktor handeln. === Legionella pneumophila is the causative agent of Legionnaires’ disease. It is able to replicate in cells of the respiratory tract namely the alveolar macrophages. In the environment, L. pneumophila, like other Legionellae lives in fresh water habitats and replicates intracellularly in protozoa. Therefore the pathogenic species of the genus Legionella possess a dual host system. Until now, very little is known about the host specificity of phylogenetically different Legionella species. This work revealed that the amoeba Acanthamoeba castellanii can serve as a host for most of the Legionella species tested. In contrast, in Hartmannella vermiformis and Naegleria gruberi only a reduced number of different Legionella species are able to replicate intracellularly. In all three amoeba species the environmental isolates LLAP 10 and L. lytica, as well as the pathogenic L. pneumophila, showed the highest replication rate among the Legionella species tested. In the ciliate T. pyriformis, the number of replicating Legionella species and the replication rate are diminished. Therefore amoebae are more suitable than ciliates as a host for Legionella infections. A major aim of this work was to establish Dictyostelium discoideum as a new host model system. This soil amoeba is genetically well studied. Furthermore, there are several different methods for the manipulation of the genome. Therefore it is possible to examine the host-pathogen interaction from the perspective of the host. The intracellular replication of LLAP 10, L. lytica and L. pneumophila in D. discoideum has been shown by determination of CFU-values in infection assays, as well as by fluorescent and electron microscopy methods. For L. pneumophila, it could be shown with FACS-analysis that the bacteria live in a phagosome with an almost neutral pH. This corresponds to the observed results in phagosomes in human macrophages and amoebae. All other Legionella species, as well as the food bacterium Klebsiella aerogenes, and heat killed L. pneumophila, are found in an acidic vesicle. Moreover, phagolysosom fusion was inhibited by L. pneumophila as demonstrated by co-localization studies with the lysosomal marker DdLIMP. No co-localization could be shown with L. pneumophila, while non replicating Legionellae clearly indicated that DdLIMP was integrated in the phagosomal membrane. Using a specific profilin minus mutant of Dictyostelium it could be shown by FACS-analysis that the uptake of Legionellae in these mutant cells occurs with a higher phagocytosis rate. Furthermore, the intracellular replication rate of Legionella bacteria is slightly increased. Profilin is an actin binding protein which is involved in regulation uptake processes. A method for isolating bacteria containing phagosomes from Dictyostelium was also established. Because it was not possible to isolate bacteria labeled bead phagosomes magnetically, a density gradient centrifugation was used. Contaminating lysosmes were eliminated by loading these organelles with iron particles and the use of an electromagnet. Contaminating mitochondria were eliminated by “heavy labeling” the organelles with a substrate for the succinat dehydrogenase and thereby increasing the specific density. Analysis of the phagosomal proteom occurred by measuring enzyme activities and western blotting experiments. No differences in the amount of lysosomal markers could be detected between phagosomes harboring living or dead L. pneumophila and phagosomes harboring LLAP 10 or K. aerogenes, respectively. In contrast, 2D gel electrophoresis revealed four proteins expressed in a greater amount in phagosomes containing dead L. pneumophila, and one protein specific for proteins harboring living L. pneumophila. This protein could be a host factor which is recruited to the phagosome by L. pneumophila