Etablierung eines hochsensitiven liposomalen Transfektionssystems zur Untersuchung der Aktivität des humanen Insulingenpromotors in ß-Zelllinien und primären ß-Zellen des endokrinen Pankreas des Menschen
Die Insulinbiosynthese in ß-Zellen des endokrinen Pankreas wird auf transkriptioneller Ebene durch die Aktivität des Insulingenpromotors reguliert. Die detaillierte Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors erfolgte bisher nur in speziesdifferenten ß-Zelllinien, da glukosesensitive ß-Zel...
| Main Author: | |
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| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | deu |
| Published: |
2008
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| Subjects: | |
| Online Access: | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/2961 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36407 https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36407 https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/2961/Diss_Hohloch.pdf |
| Summary: | Die Insulinbiosynthese in ß-Zellen des endokrinen Pankreas wird auf transkriptioneller Ebene durch die Aktivität des Insulingenpromotors reguliert. Die detaillierte Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors erfolgte bisher nur in speziesdifferenten ß-Zelllinien, da glukosesensitive ß-Zelllinien aus dem Pankreas des Menschen nicht verfügbar sind. Es ist jedoch bekannt, dass signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation der Genexpression in unterschiedlichen Spezies existieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die spezifische Untersuchung der Regulation des humanen Insulingenpromotors hochsensitiv in primären humanen ß-Zellen des endokrinen Pankreas des Menschen möglich ist. Dazu wurde ein Vektor kloniert, der das SEAP (secreted alkaline phosphatase)-Reportergen unter der Kontrolle des -336 bp langen humanen Insulingenpromotors enthält. Im Laufe verschiedener Transfektionsexperimente mit dem Vektor p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (Positivkontrolle) und pSEAP2-Basic (Negativkontrolle) sowohl in INS-1-ß-Zellen, in beta-TC3-Zellen als auch in primären humanen ß-Zellen, zeigten sich in den luminometrisch bestimmten SEAP-Aktivitäten, die als Maß für die Aktivität des humanen Insulingenpromotors dienen, deutliche Unterschiede zwischen den transkriptionellen Aktivitäten der einzelnen Vektoren. Dieses System eignet sich also ausgezeichnet für die hochsensitive Analyse der Insulingenpromotoraktiviät. Zur detaillierteren Analyse wurden 5’-Deletionskonstrukte des Vektors p-336hInsP-SEAP konstruiert und damit INS-1- und beta-TC3-Zellen transient transfiziert. In beiden Zelllinien wurden Experimente bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen durchgeführt, um daraus Rückschlüsse auf die Glukoseresponsivität des humanen Insulingenpromotors ziehen zu können. Dabei zeigte der humane Insulingenpromotor die aus Versuchen mit dem RattenInsulingenpromotor 1 erwartete Glukoseresponsivität. Allerdings ließ sich keine Abnahme der transkriptionellen Aktivität des Promotors bei Abnahme der Länge der Konstrukte beobachten. Unter Verwendung von Effectene® als Transfektionsreagenz eignet sich das SEAP-System zur Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors in primären insulinproduzierenden Zellen aus dem menschlichen Pankreas. === Insulin biosynthesis in pancreatic beta-cells is primarily regulated at the transcriptional level by the activity of the insulin promoter. Due to the lack of human pancreatic beta-cell lines, detailed analysis of the regulation of the human insulin promoter was restricted in the past to heterologous rat, mouse and hamster pancreatic beta-cell lines, although it is known, that substantial differences exist in transcriptional regulation of genes in different species. Here the development of a method for specific investigation of the regulation of the human insulin promoter in primary human pancreatic beta-cells in isolated pancreatic islets from human donor organs is described. A vector was constructed, that expresses secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a reporter gene under the control of -336 base pairs of the human insulin promoter. Doing different transfection experiments using the vectors p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (positive control) and pSEAP2-Basic (negative control) in INS1-beta-cells, beta-TC3-cells and also in primary human pancreatic beta-cells, distinct differences between the activity of the several vectors were shown through SEAP activity monitored by a fluorescent assay in the culture supernatant. To get more detailed information, 5’-deletions of the human insulin promoter were made and used for transfection of INS1- and beta-TC3-cells. It was possible to demonstrate glucose dependent activation of the human insulin promoter in both cell-lines. Using Effectene® as transfection reagent it is possible to analyse the regulation of the human insulin promoter activity in primary human pancreatic beta-cells. This will help to elucidate the molecular mechanisms of insulin biosynthesis in the human endocrine pancreas in physiology and diabetes mellitus. |
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