Molekulare Differenzierung von Mykobakterien

• Main Author: Dostal, Stefan
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2001
• Subjects: ddc:610
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/281; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3348; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3348; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/281/dostal.pdf

Die Differenzierung von Mykobakterien auf Speziesebene mithilfe von herkömmlichen biochemischen Testverfahren ist langwierig, was zu signifikanten Verzögerungen in der Diagnostik führt. Molekulare Identifizierung hingegen weist, verglichen mit der phänotypischen Identifizierung, zwei entscheidende Vorteile auf: es kommt dabei zu einem Geschwindigkeitszuwachs und zu einer höheren Genauigkeit des Diagnoseerfahrens. Der Informationsgehalt des 5’-Endes des 16S-rRNA-Gens ist ausreichend für die Identifizierung der meisten bakteriellen Spezies. Wegen der vielen fehlerhaften Datenbestände können öffentliche Sequenzdatenbanken die benötigten Referenzsequenzen jedoch nicht zur Verfügung stellen. Es wurde deshalb eigens eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Sequenzen geschaffen. Die Sequenzen beinhalten beide Stränge der 5’-16S-rDNA (E. coli-Position 54-510) von 125 Stammsammlungisolaten. Dabei wurden alle bis zum 31.03.2000 valide beschriebenen Arten (n=89) und einige weitere, bereits veröffentlichte Sequevare-Varianten eingeschlossen. Konnten Stämme anhand der 16S-Sequenzen nicht unterschieden werden, wurde zusätzlich die Sequenz der „Internal Transcribed Spacer Region“ bestimmt (n=45). Insgesamt existierten von den Stämmen, die anhand ihrer 16S-rDNA-Sequenz nicht eindeutig zu identifizieren waren, 77 Isolate in der öffentlichen Datenbank Genbank. Den neu analysierten Sequenzen gegenübergestellt weisen diese im paarweisen Vergleich eine durchschnittliche Diskrepanz von 4,31 Basen auf. Durch die vergleichende 5‘-16S-rDNA-Sequenzanalyse war es möglich 64 der 89 validen Spezies zu identifizieren (71.9%). Nach Hinzunahme der ITS-Sequenz war es möglich, weitere 15 Spezies zu differenzieren. Nur die Arten des M. tuberculosis complex, M. marinum und M. ulcerans und die M. avium Subspezies konnten weder durch 5‘16S-rDNA-Sequenzanalyse noch anhand der ITS-Sequenz differenziert werden. Die Sequenzen aller Stämme sind abrufbar in der Datenbank des RIDOM-Projekts (“Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms”). Weiterführende Informationen (z.B. taxonomischer oder medizinischer Art) vervollständigen zusammen mit einem Algorithmus zur genotypischen Identifizierung aller valide beschriebenen Mykobakterien dieses Angebot. Nach ausführlicher Analyse verschiedener Mykobakterien Spezies ist es nun in der Tat möglich, die meisten Mykobakterien Arten anhand der vergleichenden Seqenzanalyse der 16S-rDNA und ITS zu unterscheiden. Voraussetzung hierfür ist eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Referenzsequenzen. Bereits in naher Zukunft ist die Anwendung dieses Verfahrens im Routinebetrieb, v.a. in Referenzlaboratorien, denkbar. === Differentiation of mycobacteria to the species level by conventional biochemical tests is laborious, leading to significant delays in diagnosis. Molecular identification on the other hand provides two primary advantages to phenotypic identification: rapid turn-around time and improved accuracy. The information content of the 5'-end of the 16S-rRNA gene is sufficient for identification of most bacterial species. However, sequence based identification is hampered by many faulty sequence entries in publicly accessible databases. In order to establish an improved 16S-rDNA sequence database for identification of clinical isolates both strands of the 5'-16S-rDNA (E. coli position 54-510) from 125 mycobacterial culture collection isolates were sequenced. All until 31.03.2000 valid described species (n=89) and some published sequevar variants were included. If the 16S rDNA sequences were not discriminatory enough, the internal transcribed spacer (ITS) region sequences (n=45) were also determined. In total 77 identical 16S-rDNA-strains had been sequenced by others before. Comparing these GenBank entries with our sequences, there were on average 4.31 differences. By 5'-16S-rDNA sequencing it was possible to identify 64 of 89 different mycobacterial species (71.9%). With the additional input of the ITS sequence, further 15 species could be differentiated. Only M. tuberculosis complex species, M. marinum and M. ulcerans and the M. avium subspecies could neither be differentiated by 5'-16S rDNA- nor by ITS-sequencing. The sequences are available for public similarity searches in the database of the RIDOM project (“Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms”). Further information (e.g. taxonomic, medical) together with an algorithm for genotypic identification of all mycobacteria complements this service. In conclusion, it could be shown in this exhaustive analysis of different mycobacterial species, that it is indeed possible to differentiate most mycobacterial species by sequence analysis of 16S-rDNA or ITS, if a high quality sequence reference database is available. This technique should be, therefore, considered for routine application especially in reference laboratories in the future.