Funktionsanalyse alpha2-adrenerger Rezeptoren auf molekularer und transgener Ebene

• Main Author: Schickinger, Stefanie
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2008
• Subjects: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer; Adrenergisches System; Alpha-2-Rezeptor; Transgene Tiere; Grün fluoreszierendes Protein; Sympathikus; Noradrenalin; Adrenalin; ddc:610
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/2626; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31667; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31667; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/2626/SchickingerStefanie_Diss.pdf

alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielfältige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzelluläre Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle für die funktionelle Diversität der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellulären Lokalisation der Rezeptoren abhängt. Hierfür wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Phäochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Fortsätze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformationsänderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellulärer Lokalisation abhängig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen höhere Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zusätzlich zur Diversität der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zelluläre Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle für dessen Funktion spielt. === alpha2-adrenergic receptors of which three different subtypes were cloned (alpha2A, alpha2B, alpha2C), are part of the family of G-protein coupled receptors and mediate many physiological functions of the transmitters adrenaline and noradrenaline. This study was initiated to determine whether receptor subtypes, their subcellular localization or the status of differentiation of a cell are responsible for the functional diversity of effects of alpha2-adrenergic receptors in vivo. In the first part of this project a transgenic mouse model was characterized, in which alpha2-adrenergic receptors were expressed under control of the dopamine-beta-hydroxylase-promotor in adrenergic neurons selectively. This model was used to test whether a single receptor subtype has identical functions in different neurons of the sympathetic nervous system in vivo. Transgenic alpha2A-adrenergic receptors inhibited the release of noradrenaline from sympathetic nerves in vivo, but not the exocytosis of adrenaline from the adrenal medulla. Therefore the question arose whether the functions of receptors are dependent on cell morphology, the status of differentiation of cells or the subcellular localization of receptors. To address this question, alpha2A-receptors were tagged with variants of the green fluorescent protein and investigated by means of FRET fluorescence microscopy. In PC12 rat pheochromocytoma cells which were stimulated by nerve growth factor to develop neurites, the conformational changes of alpha2A-adrenergic receptors upon agonist activation, however, did not dependent on the status of cellular differentiation or on the subcellular localization of receptors. Only in transiently transfected cells, higher agonist concentrations were necessary for the activation of receptors as determined by FRET microscopy. These findings demonstrate that the cellular context in which receptor subtypes are expressed play an essential role for their function.